董國文 ，陳一平,2，陳 飄 ,2，張麗華

（1.三明學(xué)院 資源與化工學(xué)院 福建 三明 365004；2.福建農(nóng)林大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，福建，福州 350002）

砷的生物地球化學(xué)調(diào)查表明自然環(huán)境中微生物在砷的化學(xué)形態(tài)及循環(huán)方面起到至關(guān)重要的作用[1-2]。過程控制砷釋放到地下水系統(tǒng)很復(fù)雜并且已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究，但仍然還存在強(qiáng)烈的爭論。已有幾個(gè)微環(huán)境實(shí)驗(yàn)研究表明土著金屬還原微生物(例如Geobacteraceae)在砷釋放到地下含水層中起到關(guān)鍵作用[3-7]。但有關(guān)這些土著微生物群落在砷遷移轉(zhuǎn)化過程中的詳細(xì)作用還沒有特別描述。而可溶的自然小分子有機(jī)酸是土壤中不穩(wěn)定的碳源之一，其中，乙酸一旦釋放到土壤溶液中可能被土壤微生物利用，加速金屬礦物的風(fēng)化。淹水能改變土壤氧化還原電位引起土壤短暫缺氧，吸附到鐵氧化物顆粒的砷很容易通過鐵或砷還原微生物的活動(dòng)而溶解。因此，在環(huán)境條件改變下土著微生物活動(dòng)對沉積物中砷移動(dòng)的重要性值得深入研究。特別是對環(huán)境中不可培養(yǎng)的砷代謝微生物的豐度和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步的研究，以確定其在砷遷移轉(zhuǎn)化過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 沉積物樣品采集

本試驗(yàn)供試沉積物采自湖南省石門縣雄黃礦廢棄礦區(qū)附近。樣品采集后密封保存于4°C冰箱備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)所用沉積物其有效態(tài)砷含量在34.15 mg·kg-1，沉積物樣品厭氧培育采用105 mL血清瓶預(yù)先滅菌處理，然后添加（20±1）g沉積物，加入24 mL無菌水或溶液。液面下氮吹30 min，液面上氮吹30 min，然后蓋上灰色丁基橡膠塞，用卡口鉗將鋁皮密閉，30°C暗處培養(yǎng)。沉積物中主要添加乙酸鈉和Fe(III)[8]，處理方式見表1。

1.3 分析方法

樣品中As(Ⅲ)的濃度采用氫化物發(fā)生原子熒光法(AF-610B北京瑞利)測定[9]，總砷采用ICP-MS（安捷倫7700X）測試。Fe(Ⅱ)的濃度采用Ferrozine法來測定(TU1900，北京普析)[10]。樣品中CO2用10 μL微量進(jìn)樣器取樣，濃度采用氣相色譜測試(GC-960，上海海欣)。測試條件為柱溫50℃，熱導(dǎo)檢測，載氣為氬氣。

沉積物樣品總DNA的提取純化按照Fast DNA Spin Kit for soil(MP Biomedical USA)的操作說明進(jìn)行。對砷的異化還原微生物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，方法是采用nested PCR，先用引物F8和RGeobacteraceae-825進(jìn)行擴(kuò)增[11-12]，目的片段在800 bp左右，產(chǎn)物割膠純化后再PCR，引物用Bacteria specific primers F357GC和R518[13]，PCR反應(yīng)的產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。利用DGGE（變性梯度凝膠電泳）電泳儀系統(tǒng)(DcodeTM，Biorad)分離PCR產(chǎn)物，并克隆測序（上海生工）。分別采用Geobacteraceae特異引物F494-R825[14]和 As(Ⅴ)異化還原菌功能基因引物arrAF4-arrAR4[15]進(jìn)行real-time PCR(ABI Step One Plus)來分析沉積物中Fe(Ⅲ)和As(Ⅴ)還原菌的相對豐度。

2 結(jié)果與討論

2.1 厭氧環(huán)境微生物對沉積物中砷的釋放

本實(shí)驗(yàn)以尾礦區(qū)附近高砷沉積物作為研究對象，在厭氧微環(huán)境條件下，考察外加有機(jī)碳源乙酸鈉、可溶的Fe(Ⅲ)和不溶的Fe(Ⅲ)對沉積物中微生物釋放砷的影響，結(jié)果見圖1。在厭氧環(huán)境下，與無菌控制樣品相比，沉積物中砷的遷移主要是微生物的作用。滅菌樣品中砷的釋放相對較少，說明礦物表面解吸不是主要的因素。沉積物中添加乙酸鈉和同時(shí)添加乙酸鈉及可溶Fe(Ⅲ)后，釋放到水體中的砷濃度分別為59.84，61.36 mg·L-1，且主要是 As(Ⅲ)(＞90%)。從砷隨著時(shí)間釋放的曲線來看，培育前期加入可溶的Fe(Ⅲ)會(huì)減少砷的釋放，后期會(huì)增加砷的釋放，但主要影響砷釋放的還是乙酸鈉的貢獻(xiàn)。只加水的樣品中也有一定砷的釋放，說明土著厭氧微生物還可以利用沉積物本身的有機(jī)碳源進(jìn)行呼吸代謝。而加入Fe(OOH)膠體的樣品釋放到水體的砷幾乎可以忽略，說明Fe(OOH)膠體對微生物釋放到水體中的砷有吸附作用，從滅菌控制樣品中也可以看出（見圖2），加入Fe(OOH)膠體的樣品中釋放到水體中的砷的濃度比其它樣品明顯低。

從圖3可以看出，厭氧環(huán)境下沉積物中釋放砷的同時(shí)還有鐵的釋放，但鐵的釋放比砷要慢，但Fe(Ⅲ)一直都有被還原，不管是加入可溶的還是不溶的Fe(Ⅲ)，都能促進(jìn)微生物還原Fe(Ⅲ)。

圖1 厭氧條件下微生物對沉積物中砷的釋放

圖 2 厭氧條件下沉積物中砷的釋放(非生物作用)

圖 3 厭氧條件下微生物對沉積物中Fe(II)的釋放

2.2 厭氧環(huán)境微生物對沉積物中有機(jī)碳的轉(zhuǎn)化

根據(jù)圖4可知，在厭氧環(huán)境下，外源的有機(jī)碳源乙酸鈉和Fe(Ⅲ)都能夠促進(jìn)沉積物中土著微生物的活性。以有機(jī)物作為電子供體產(chǎn)生CO2的貢獻(xiàn)大小依次為NaAc+Fe(Ⅲ)＞Fe(OOH)＞NaAc＞H2O。從有機(jī)碳的轉(zhuǎn)化可以看出，加入可溶的或不溶的Fe(Ⅲ)后，CO2的濃度顯著增加，說明Fe(Ⅲ)的加入促進(jìn)了鐵還原微生物的生長，異化鐵還原明顯加強(qiáng)，同時(shí)也說明沉積物中鐵還原菌非常豐富。

2.3 沉積物中功能性微生物分析

在厭氧環(huán)境下沉積物中鐵的呼吸代謝通常與Geobacteraceae科微生物活動(dòng)相關(guān)[12,16]。故采用特異引物F8和RGeobacteraceae-825對鐵還原微生物進(jìn)行PCR-DGGE分析。測序結(jié)果見表2。在厭氧環(huán)境下，沉積物中有22個(gè)優(yōu)勢菌種，大部分屬于δ變形菌門，主要是Geobacter(地桿菌屬)，另外兩個(gè)分別屬于Chloroflexi(綠彎菌門)和Firmicutes(厚壁菌門)。典型鐵還原菌Geobacteraceae在沉積物中豐富，其中大部分優(yōu)勢種群與有機(jī)碳的轉(zhuǎn)化和Fe(Ⅲ)還原相關(guān)[17-23]。

圖4 不同處理對沉積物中CO2產(chǎn)生量的影響

表2 測序序列比對結(jié)果

沉積物中提供電子供體和電子受體對異化金屬還原有重要影響。鐵還原菌(IRB)作用下的異化鐵還原反應(yīng)對于控制沉積物中砷污染有重要意義，因此很多研究都對IRB在這個(gè)過程中的作用進(jìn)行了探討。基于前面研究發(fā)現(xiàn)厭氧條件下釋放出來的砷的量要大于鐵的量，有研究表明，砷吸附于飽和水鐵礦，溶解1 mol Fe只能釋放0.16 mol砷[24]。同時(shí)二價(jià)鐵含量較低，由此推測礦區(qū)沉積物中可能還有能夠直接還原As(Ⅴ)的微生物。所以分別考察了有機(jī)碳和Fe(Ⅲ)在厭氧條件下對沉積物中 Fe(Ⅲ)和 As(Ⅴ)還原微生物豐度的影響，以獲得沉積物中砷釋放的直接證據(jù)，結(jié)果見圖5。

圖 5不同處理下礦區(qū)沉積物中Geobacteraceae科微生物拷貝數(shù)

由圖5可知，添加Fe(OOH)后，樣品中Geobacteraceae科微生物拷貝數(shù)上升最多，加入乙酸鈉后，樣品中Geobacteraceae科微生物拷貝數(shù)也有增加，但沒有加入Fe(OOH)多。說明三價(jià)鐵作為電子供體對樣品中Geobacteraceae科微生物富集的影響更明顯。通過DGGE分析也發(fā)現(xiàn)添加Fe(OOH)后礦區(qū)沉積物中Geobacteraceae科微生物種類更多。這可能是由于鐵膠顆粒較小，有些可能都是納米級的，納米顆粒的鐵氧化物能促進(jìn)微生物對鐵的異化還原[25]，所以加入鐵膠后促進(jìn)沉積物中異化鐵微生物的生長。但正是由于鐵膠顆粒小，比表面積大，使得鐵膠對砷有很強(qiáng)的吸附作用，所以遷移到水體的砷很少。鐵膠雖然在生物方面有促進(jìn)鐵還原的作用，但非生物的物理吸附也不可忽視。總之，加入三價(jià)鐵和乙酸鈉后，對Geobacteraceae科微生物生長有明顯促進(jìn)作用，也再次證實(shí)Geobacteraceae科微生物活動(dòng)對沉積物中砷的釋放有重要影響。

通過砷的遷移轉(zhuǎn)化數(shù)據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，砷遷移出來的最高濃度為61.4 mg·L-1，換算遷移的量為73.7 mg·kg-1。而厭氧環(huán)境下鐵最高遷移量是37.4 mg·kg-1。根據(jù)鐵砷溶解釋放比例(molar ratio As/Fe=0.16)折算，由于鐵溶解釋放砷的量只有8.0 mg·kg-1，遠(yuǎn)低于砷釋放的總量，當(dāng)然還有其他金屬氧化物還原而引起砷的釋放，例如錳氧化物。不過金屬氧化物還原引起的砷的釋放主要還是鐵錳氧化物，因此推測此礦區(qū)沉積中砷的釋放還存在其它關(guān)鍵釋放機(jī)制，例如能夠直接還原As(Ⅴ)的微生物。16s rRNA被廣泛應(yīng)用于對微生物多樣性的檢測。然而在微生物生態(tài)學(xué)中，物種鑒別并不一定與新陳代謝有關(guān)。另一種研究微生物活動(dòng)的方法就是找尋功能基因。例如對硫還原菌(SRB)來說，大多數(shù)研究都致力于DSR片段的研究，這一成就被用于SRB在耐鹽環(huán)境中的鑒別。同樣的研究發(fā)現(xiàn)arrA功能基因是異化砷酸鹽微生物(DARPs)還原As(V)可靠的標(biāo)志[26]，因此利用功能基因引物arrAF4-arrAR4進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，并對沉積物中異化砷酸鹽的微生物豐度進(jìn)行了熒光定量PCR分析，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，添加乙酸鈉后，沉積物中DARPs功能基因arrA拷貝數(shù)顯著增加，而加入三價(jià)鐵后略有增加，說明乙酸鈉主要是富集DARPs。與前面熒光定量PCR分析Geobacteraceae科微生物相比，DARPs功能基因arrA拷貝數(shù)要高出一到兩個(gè)數(shù)量級，說明DARPs相對豐度更高，意味著DARPs對礦區(qū)沉積物中砷的釋放貢獻(xiàn)更大。也就是說沉積物中除了Geobacteraceae科微生物對砷的遷移轉(zhuǎn)化起作用外，起主要作用的微生物還有DARPs。陳錚等在研究幾種含有醌類結(jié)構(gòu)的電子中介體對沉積物中砷/鐵遷移時(shí)發(fā)現(xiàn)，沉積物中砷/鐵遷移到水體中主要是金屬還原菌的作用，外源載體表面所含有的醌類結(jié)構(gòu)及導(dǎo)電性是影響微生物胞外電子傳遞與砷/鐵形態(tài)轉(zhuǎn)化關(guān)系的重要原因[27]。

沉積物中砷釋放機(jī)制既包括含砷鐵氧化物的還原溶解[4]，還包括吸附的 As(Ⅴ)直接還原為 As(Ⅲ)。As(Ⅴ)的微生物還原機(jī)制主要分成兩類：解毒和異化還原。As(Ⅴ)，由于結(jié)構(gòu)類似磷，很容易通過磷的攝取蛋白進(jìn)入細(xì)胞。微生物已經(jīng)發(fā)展了一種解毒策略來保護(hù)自己免受As(Ⅴ)的毒害。例如，在有氧和厭氧環(huán)境下通過砷的耐受系統(tǒng)(ars)將 As(Ⅴ)還原為 As(Ⅲ)。有些厭氧微生物通過耦合As(Ⅴ)的還原和氧化有機(jī)碳獲得能量。這些異化砷還原微生物在呼吸過程中以As(Ⅴ)作為最終電子受體。微生物還原砷能夠增加砷的移動(dòng)，因?yàn)锳s(Ⅲ)的移動(dòng)能力比As(Ⅴ)更強(qiáng)。

圖6 不同處理下礦區(qū)沉積物中砷arrA功能基因拷貝數(shù)

3 結(jié)論

本文在厭氧環(huán)境下，添加乙酸鈉和Fe(Ⅲ)后微生物對沉積物中砷釋放的影響，獲得以下主要結(jié)論：

(1)礦區(qū)沉積物中砷的釋放主要是微生物的作用，并伴隨鐵的釋放；

(2)在厭氧微環(huán)境下，添加乙酸鈉后，主要以As(Ⅲ)的形式釋放到水體中，F(xiàn)e(OOH)對砷有吸附作用；

(3)乙酸鈉和三價(jià)鐵對沉積物中的微生物都有明顯富集作用，其中乙酸鈉主要促進(jìn)DARPs的生長，F(xiàn)e(OOH)主要促進(jìn)Geobacteraceae科微生物的生長；

(4)厭氧環(huán)境下沉積物中砷的釋放是鐵還原菌Geobacteraceae和砷還原菌DARPs共同作用的結(jié)果，其中DARPs起關(guān)鍵作用；

(5)在礦區(qū)沉積物中，富集的微生物中優(yōu)勢種屬主要是由δ變形菌門、Chloroflexi(綠彎菌門)和Firmicutes(厚壁菌門)所控制。