劉韻璐 王 洋

(1. 四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所，成都 610000)(2. 成都市雙流區(qū)婦幼保健院，成都 610000)

妊娠期高血壓疾病(hypertensive disorder complicating pregnancy, HDCP) 是妊娠期特有的疾病，報道顯示[1]，該病在我國的發(fā)病率為9.4%～10.4%，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦死亡的最主要原因。HDCP以妊娠20周后出現(xiàn)高血壓、尿蛋白為主要特征，與甲狀腺功能減退的臨床表現(xiàn)類似，相關(guān)臨床研究表明[2-4]，HDCP與甲狀腺激素功能的改變密切相關(guān)，可能參與并促進(jìn)了甲狀腺功能減退的發(fā)生、發(fā)展。目前，對于HDCP如何影響甲狀腺功能改變的機制尚不明確，相關(guān)研究大多限于臨床分析，還缺乏有力的基礎(chǔ)實驗研究依據(jù)。碘化甲狀腺氨酸脫碘酶(iodothyronine deiodinases, DI)由三種含硒整合膜蛋白組成，能特異性調(diào)節(jié)組織和細(xì)胞中的甲狀腺激素水平。循環(huán)血液中活性強大的T3主要是由肝臟中的Ⅰ型脫碘酶(DIO-Ⅰ)催化T4轉(zhuǎn)化生成[5]，研究HDCP狀態(tài)下DIO-Ⅰ的基因水平的表達(dá)有助于進(jìn)一步解釋HDCP參與甲狀腺功能紊亂的機制。因此，本研究通過建立妊娠期高血壓疾病大鼠模型，觀察HDCP對大鼠肝臟中DIO-Ⅰ的表達(dá)及血甲狀腺激素的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

選擇體質(zhì)量280～300 g SPF級雌性SD大鼠20只，體質(zhì)量330 g～350 g SPF雄性大鼠10只，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物質(zhì)量合格證號：0001133。動物于SPF級屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)，環(huán)境溫度20～24 ℃，相對濕度：40%～70%，12 h/12 h明暗交替，實驗動物使用許可證號：SYXK[川]2018-058。

1.1.2試劑及儀器

亞硝基左旋精氨酸甲酯(nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME)，美侖生物，中國；Trizol, Invitrogen，美國; RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，ABM公司，中國；SYBR Green 1熒光染料試劑盒，GeneCopoeia公司，美國；DIO-Ⅰ、GAPDH引物，Invitrogen，美國；TT3、TT4、FT3、FT4 ELISA檢測試劑盒，Elabscience，中國; BP-6 A無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司; Quant Studio 6 Flex 實時熒光定量PCR儀、Mini Amp PCR儀，Applied Biosystems;KHBST-360酶標(biāo)儀，上?？迫A實驗系統(tǒng)有限公司。

1.2 方法

本實驗方案經(jīng)四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所倫理委員會審查通過，批件編號：倫審2019第001號。

1.2.1動物分組：根據(jù)大鼠體質(zhì)量按均衡隨機分組法將發(fā)情期大鼠雌性和雄性大鼠以2∶1合籠過夜，次日清早用生理鹽水蘸濕棉簽進(jìn)行陰道涂片，鏡下觀察若有精子視為妊娠第1天[6]。將孕鼠稱重編號，隨機分為正常妊娠對照組(n=10)和妊娠高血壓模型組(n=10)。

1.2.2造模方法：自妊娠第13天開始，模型組孕鼠皮下注射L-NAME 250 mg/kg·d-1，至妊娠第21天。對照組孕鼠皮下注射生理鹽水，注射體積和天數(shù)與模型組一致。兩組孕鼠均于妊娠第11天起，每日用BP-6A無創(chuàng)血壓儀監(jiān)測尾動脈血壓；并用代謝籠收集孕鼠妊娠第12、15、17、20天24 h尿液，應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行24 h尿蛋白定量檢測。當(dāng)模型組與對照組比較，血壓和尿蛋白顯著性高于對照組(P<0.05)，且伴動作遲緩、懶動等行為學(xué)指標(biāo)改變時，視為造模成功。

1.2.3肝臟DIO-Ⅰ表達(dá)檢測：兩組孕鼠妊娠第21天，用5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠后，①取孕鼠肝臟左葉，PBS緩沖液沖洗周圍血污，置于液氮中凍存。②檢測當(dāng)日，取研磨后的凍存肝臟100 mg，應(yīng)用Trizol試劑盒提取RNA，采用變性瓊脂糖凝膠電泳對提取RNA進(jìn)行驗證。③按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行RT，合成cDNA。④將所有cDNA樣本分別配置實時定量PCR反應(yīng)體系，體系配置如下：SYBR Green 1熒光染料10 μL，上游引物1 μL, 下游引物1 μL，dNTP 1 μL，Taq聚合酶2 μL，待測樣本cDNA 5 μL，ddH2O 30 μL；將配置好的PCR反應(yīng)溶液置于實時定量熒光PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，每個反應(yīng)做3個復(fù)孔。⑤反應(yīng)條件如下：預(yù)變性，95 ℃，30 s，共做1個循環(huán)；PCR反應(yīng)，95 ℃，5 s；60 ℃，34 s，共做40個循環(huán)；熔解反應(yīng)，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。⑥引物設(shè)計軟件Primer Premier5.0，內(nèi)參基因GAPDH和DIO-Ⅰ基因引物序列見表1。⑦所有復(fù)孔均取平均值進(jìn)行計算，以內(nèi)參基因的表達(dá)量對結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

表1 PCR引物

1.2.4血液甲狀腺激素檢測：兩組孕鼠妊娠第21天，用5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠后，將孕鼠仰臥固定于操作臺，分離腹主動脈，用真空采血管采集動脈血，3 000 r/min離心10 min，收集上清液儲存于-80 ℃。檢測當(dāng)日，用ELISA試劑盒法檢測孕鼠血清中TT3、TT4、FT3、FT4的濃度。

1.3 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠肝臟DIO-Ⅰ基因表達(dá)比較

妊娠高血壓孕鼠肝臟中DIO-Ⅰ基因表達(dá)水平，較正常妊娠對照組，顯著下降(P<0.05)。見圖1。

圖1 實時熒光定量PCR檢測DIO-Ⅰ基因相對表達(dá)水平比較

2.2 兩組大鼠甲狀腺激素水平比較

與正常妊娠對照組比較，妊娠高血壓模型組大鼠TT3、FT3值顯著下降(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清甲狀腺激素水平比較

3 討論

妊娠期高血壓疾病(hypertensive disorder complicating pregnancy, HDCP)是妊娠期婦女特有又常見的疾病，以不同程度的高血壓、蛋白尿、水腫等為主要臨床特征[7]，其致病機制尚不明確，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦死亡的主要原因。HDCP積累全身多個臟器[8]，其與甲狀腺功能改變的密切聯(lián)系已被諸多臨床研究[9-11]所證實。但HDCP是通過哪些途徑影響到甲狀腺功能，其影響機制如何，尚不明確。而目前基于患者的臨床研究不僅在研究深度和廣度上都存在局限性，其研究方法在倫理和方法上也受到限制，基于此，本課題組參考相關(guān)文獻(xiàn)報道[12-14]，通過皮下注射L-NAME構(gòu)建了穩(wěn)定的HDCP大鼠模型，應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)研究了HDCP時肝組織中脫碘酶在基因表達(dá)水平上的改變，并結(jié)合血液中甲狀腺激素水平的改變，探討了HDCP對甲狀腺功能影響的可能機制，為該疾病的診治提供了可靠的實驗依據(jù)。

人體中一共存在3種脫碘酶，分別為Ⅰ型脫碘酶(DIO-Ⅰ)、Ⅱ型脫碘酶(DIO-Ⅱ)、Ⅲ型脫碘酶(DIO-Ⅲ)，3種酶在不同部位和環(huán)節(jié)發(fā)揮脫碘作用，以調(diào)節(jié)甲狀腺激素的生物活性[15]。其中DIO-Ⅰ主要存在于肝臟中，是外周組織中T4向T3轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵酶，研究表明[16-17]，除少量T3是由甲狀腺直接分泌入血，機體中75%～80%發(fā)揮作用的T3是由T4在DIO-Ⅰ作用下脫碘合成，DIO-Ⅰ在甲狀腺激素代謝和功能中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。本研究觀察到，妊娠高血壓疾病模型組大鼠肝臟中的DIO-ⅠmRNA的表達(dá)顯著下降，相應(yīng)的，其血清中TT3和FT3的水平也顯著降低。究其原因，可能是由于HDCP時，全身微小血管痙攣，各臟器局部灌流減少，導(dǎo)致肝臟成為HDCP的慢性攻擊靶器官[18-19]，使DIO-Ⅰ基因表達(dá)受到影響，外周T4脫碘效率下降，T3生成降低。此外，由于受妊娠期雌激素的影響，使得血液中甲狀腺素結(jié)合球蛋白(TBG)維持在正常范圍內(nèi)[20]，而T4釋放入血后，一部分T4與TBG結(jié)合，與血液中發(fā)揮生物活性的游離型T4相互轉(zhuǎn)換，使血液中T4達(dá)到動態(tài)平衡。T3則與TBG親和力小，主要以游離形式存在，其濃度水平主要受DIO-Ⅰ的影響[21]，因此導(dǎo)致了本研究模型組大鼠血液中TT3、FT3下降最為明顯，而TT4、FT4水平改變不明顯的結(jié)果。

綜上，本研究結(jié)果顯示，HDCP能通過降低肝臟DIO-Ⅰ基因表達(dá)水平，改變外周甲狀腺激素代謝情況，從而影響甲狀腺激素水平，但HDCP通過哪些途徑來調(diào)控DIO-Ⅰ的表達(dá)，影響DIO-Ⅰ的活性，還有待進(jìn)一步研究。