王 靜 洪炳哲 張習(xí)敬 任海勤 葛魯敏

(1.貴州盤江投資控股(集團(tuán))有限公司總醫(yī)院，盤州市 553536)(2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院，齊齊哈爾 161000)

心肌缺血再灌注損傷(MIRI)指心肌組織經(jīng)過一段時(shí)間缺血，血液恢復(fù)灌注后導(dǎo)致再灌注區(qū)心肌細(xì)胞出現(xiàn)功能障礙及進(jìn)一步損傷的現(xiàn)象。這是心臟手術(shù)、器官移植及心臟缺血性疾病中常見的損傷[1]。人參，系五加科人參屬植物，作為我國(guó)傳統(tǒng)寶貴的藥材，具有調(diào)節(jié)免疫，改善循環(huán)，抗氧化，抗炎等作用，不僅用于保健養(yǎng)生方面，還對(duì)多種疾病具有預(yù)防作用[2]。人參性溫，味甘，微苦，其主要有效成分為人參皂苷。迄今為止，大概有40余種皂苷成分被分離出來，可分為3類，人參二醇皂苷、人參三醇皂苷、齊墩果烷皂苷。其中人參三醇皂苷具有心臟保護(hù)作用，已用于心血管系統(tǒng)等方面的研究[3-4]。本研究選用Wistar大鼠作為研究對(duì)象，用人參三醇皂苷預(yù)處理后，進(jìn)行心肌缺血再灌注損傷模型的建立，觀察人參三醇皂苷對(duì)心肌缺血再灌注大鼠心肌的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物來源

選用健康SPF級(jí)Wistar大鼠120只，雌雄各半，體質(zhì)量為(220±20)g，由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為：SCXK(湘)2015-0412。大鼠于溫度為(25±2) ℃、相對(duì)濕度為30%～60%條件的動(dòng)物房中飼養(yǎng)。適應(yīng)性至少喂養(yǎng)1周后進(jìn)行正式試驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照3R原則進(jìn)行，且遵守醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)則。

1.2 試劑與設(shè)備

人參三醇皂苷(PTS)，由中南大學(xué)天然藥物化學(xué)教研室提供；生脈注射液，四川川大華西藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)17081613；PCR試劑盒，購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；ELISA試劑盒，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)等購(gòu)于深圳達(dá)科有限公司；肌酸激酶同工酶(CK-MB)試劑盒購(gòu)于南京生物工程研究所。JEM-1400EX透射電鏡：日本電子株式會(huì)社；DG3022 A酶標(biāo)儀：北京倍肯醫(yī)療；7020型全自動(dòng)生化分析儀：日本日立公司。

1.3 動(dòng)物分組

大鼠按隨機(jī)原則分成6組，每組20只。具體分組如下：假手術(shù)組(生理鹽水2 mL/kg體質(zhì)量)、模型組(生理鹽水2 mL/kg體質(zhì)量)、PTS低劑量組(人參三醇皂苷25 mg/kg)、PTS中劑量組(人參三醇皂苷45 mg/kg)、PTS高劑量組(人參三醇皂苷90 mg/kg)、陽性藥組(生脈注射液450 mg/kg)。各組大鼠于心肌缺血再灌注損傷前，即造模前，連續(xù)7 d腹腔注射給藥。

1.4 大鼠心肌缺血/再灌注動(dòng)物模型的建立

各組大鼠連續(xù)腹腔給藥7 d，于末次給藥1 h后進(jìn)行造模手術(shù)。將大鼠麻醉后固定四肢，將其綁定到心電圖儀上，記錄正常心電圖。將大鼠胸部去毛后，碘伏消毒，用手術(shù)刀沿胸左側(cè)3～4肋間打開胸腔，剪開心包，擠出心臟，從冠狀動(dòng)脈左前降支穿線結(jié)扎，送回心臟，關(guān)閉胸腔，記錄心電圖變化，結(jié)扎成功的標(biāo)志為：ST段下降或抬高0.1 mV。結(jié)扎缺血30 min后，開胸松解結(jié)扎線實(shí)現(xiàn)心肌再灌注，記錄心電圖變化情況。荷包縫合，再灌注24 h后取材料測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。假手術(shù)組僅進(jìn)行冠脈穿線不進(jìn)行結(jié)扎，其余各組均進(jìn)行穿線結(jié)扎。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1心電圖ST段的變化：各組大鼠按照實(shí)驗(yàn)分組給藥后，進(jìn)行造模手術(shù)。將大鼠麻醉后固定在溫控手術(shù)臺(tái)上，于四肢皮下插入針型電極，監(jiān)測(cè)心電，觀察結(jié)扎缺血5、30 min時(shí)及松解縫合線實(shí)現(xiàn)再灌注后5、30、60 min時(shí)心電圖的變化。

1.5.2血清指標(biāo)的測(cè)定：大鼠再灌注24 h后經(jīng)腹動(dòng)脈取血5 mL，4 000 r/min離心15 min后，取上清液，檢測(cè)血清中CK-MB、TNF-α和IL-6水平。

1.5.3心肌梗死面積的測(cè)定：大鼠取血后迅速取出大鼠心臟，用氯化鈉注射液洗凈后剪去右心室。用濾紙將水吸干后左心室稱質(zhì)量。沿心尖斷面切厚度相等的4～5片，置于0.1%的氯化硝基四氮唑藍(lán)溶液中，染色15 min，取出固定，用數(shù)碼相機(jī)照相。ImagePro Plus 6.0圖像軟件評(píng)價(jià)分析心肌梗死面積比例(正常心肌組織為藍(lán)色，梗死面積呈灰白色；心肌梗死面積比例=梗死區(qū)面積/左心總面積)。

1.5.4心肌組織病理學(xué)檢查：心肌再灌注24 h后，在結(jié)扎線附近，取缺血中央?yún)^(qū)域部分心肌組織，置于4%甲醛溶液中固定，脫水，常規(guī)切片，進(jìn)行HE染色。用中性樹膠封片，于光鏡下觀察心肌組織病理學(xué)改變。

心肌再灌注24 h后，沿心肌纖維方向取一塊梗死區(qū)域的心肌組織，置于4 ℃，4%戊二醛中固定。包埋劑包埋成塊，超薄切片，雙染色等，按常規(guī)透射電鏡要求制備樣品。用電子顯微鏡觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變。

1.5.5PCR檢測(cè)mRNA：采用總RNA提取試劑盒提取總RNA。提取后建立相應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng)條件，預(yù)變性：94 ℃，2 min；變性：94 ℃，30 s；退火：49.3 ℃，30 s；延伸：72 ℃，2 min，循環(huán)33次，最后再72 ℃延伸5 min。引物序列：Bcl-2，上游引物5’-GCGCAGATCCACCATTGCTAT-3’，下游引物5’-GCTCCGTTGCAGCCTACT TCCG-3’；Bax，上游引物5’-GTCTCTTCTACTCATCGTGC-3’，下游引物5’-AGG CGTCTATCAACTGAAAG-3’；β-actin為內(nèi)參，上游引物：5’-TGCTCGCCGG TATGTAGGCCTG-3’，下游引物：5’-TCCGTCGCCCTCATCCTGAGGTG-3’。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，以P<0.05，P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心電圖ST段的變化

心電監(jiān)測(cè)結(jié)果見表1。模型組大鼠缺血5、30 min及再灌注5、30、60 min時(shí)，心電圖ST段顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)。與模型組比較，陽性藥組大鼠缺血5、30 min及再灌注5、30、60 min時(shí)，均能顯著抑制ST段抬高(P<0.05、0.01)；PTS高劑量組大鼠缺血及再灌注后各時(shí)間點(diǎn)，同樣能顯著抑制ST段抬高(P<0.05、0.01)；PTS中劑量組大鼠缺血5、30 min及再灌注后30 min時(shí)，能顯著抑制ST段抬高(P<0.05)；而PTS低劑量組大鼠心電圖ST段無明顯變化。

2.2 血清CK-MB、IL-6、TNF-a水平

模型組大鼠血清CK-MB、IL-6、TNF-α水平較假手術(shù)組明顯增加，差異顯著(P< 0.05、0.01)。與模型組比較，陽性藥組大鼠血清各炎癥因子水平顯著降低(P< 0.05、0.01)；PTS高劑量組同樣能顯著抑制大鼠血清各炎癥因子水平(P<0.05、0.01)；PTS中劑量組能顯著抑制大鼠血清CK-MB、TNF-α水平(P<0.05)；PTS低劑量組大鼠血清水平變化不明顯，見表2。

表1 各組大鼠心電圖ST段變化

表2 各組大鼠血清生化指標(biāo)及心肌梗死面積

2.3 心肌梗死面積比例

模型組大鼠心肌梗死面積比例達(dá)到21.97%。與模型組相比，陽性藥組大鼠心肌梗死面積比例顯著降低(P<0.05)；PTS中劑量及高劑量組大鼠心肌梗死面積比例也顯著降低(P<0.05、0.01)；而PTS低劑量組心肌梗死面積比例無顯著變化。

2.4 心肌病理形態(tài)

大鼠心肌組織進(jìn)行石蠟切片、HE染色，結(jié)果見圖1。假手術(shù)組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)完整，纖維排列規(guī)則，膜正常，組織間隙正常。模型組心肌間質(zhì)出現(xiàn)明顯水腫，有大量心肌細(xì)胞壞死，中性粒細(xì)胞大量浸潤(rùn)，胞漿紅染，核消失，肌纖維被破壞。陽性藥組與模型組比較，有局部少量血管擴(kuò)張充血，心肌細(xì)胞排列較正常，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。PTS高劑量組和PTS中劑量組，與模型組比較，心肌間質(zhì)水腫明顯減輕，心肌細(xì)胞形態(tài)基本正常，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯減少。而PTS低劑量組與模型組比較，仍明顯可見心肌細(xì)胞小片壞死，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.5 心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

大鼠電鏡下心肌組織的變化見圖2。假手術(shù)組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，核仁清楚，細(xì)胞核呈長(zhǎng)橢圓型，染色質(zhì)分布均勻；胞質(zhì)內(nèi)肌節(jié)清晰；線粒體形態(tài)正常；未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原纖維沉積。模型組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)明顯受損：肌膜破裂，肌絲排列紊亂，染色質(zhì)出現(xiàn)凝聚成塊，區(qū)域性膠原纖維沉積。陽性藥組：心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完整，線粒體輕微腫脹。PTS高劑量組和PTS中劑量組，與模型組比較，心肌細(xì)胞受損明顯減輕，線粒體基本完整，細(xì)胞核異常程度減少，核仁較清楚，肌絲排列較整齊。PTS低劑量組與模型組比較沒有明顯改善，心肌細(xì)胞受損，細(xì)胞核染色塊凝聚，血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹等。

2.6 Bcl-2和Bax基因的表達(dá)

與假手術(shù)組相比，模型組Bcl-2和Bax mRNA水平明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，陽性藥組、PTS高劑量組和PTS中劑量組大鼠Bcl-2 mRNA水平明顯升高(P<0.05)，Bax mRNA水平明顯降低(P<0.05)。PTS低劑量組與模型組比較差異不明顯，結(jié)果見圖3。

圖1 大鼠心肌病理形態(tài)變化 (×200)

圖2 大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化 (×5000)

圖3 Bcl-2和Bax mRNA水平變化

3 討論

近年來，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病發(fā)病率逐年增高，心肌梗死(MI)成為人類健康的第一殺手[5]。心肌梗死是冠狀動(dòng)脈的血流急劇減少，而導(dǎo)致大量心肌壞死。治療最關(guān)鍵方法是盡快恢復(fù)血流再灌注，但有研究認(rèn)為缺血再灌注的二次損傷比心肌梗死還要嚴(yán)重，可導(dǎo)致嚴(yán)重的心律失常[6]。因此怎樣預(yù)防心肌缺血再灌注損傷變得尤為重要。

本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)，選擇大鼠心肌缺血30 min，再灌注24 h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行造模[7]。結(jié)果表明，大鼠缺血5、30 min及再灌注后5、30、60 min時(shí)，模型組比假手術(shù)組心電圖ST段明顯抬高(P<0.01)。心電圖ST段改變與心肌缺血再灌注損傷緊密相關(guān)。經(jīng)HE染色及透射電鏡下觀察模型組的心臟組織結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)確有心肌缺血壞死等改變，且血清各炎癥因子水平顯著升高，說明造模成功。經(jīng)PTS中劑量及高劑量組預(yù)處理的大鼠心肌細(xì)胞受損明顯減輕，細(xì)胞核異常程度減少，未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，且心肌梗死面積顯著低于模型組大鼠。而PTS低劑量組，可能是因?yàn)樗幬餄舛冗^小原因，心肌受損情況沒有較大改善。這說明，PTS對(duì)心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，作用強(qiáng)弱與劑量相關(guān)。

MIRI是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，涉及心肌細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、冠狀血管內(nèi)皮損傷、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等方面[8-9]。陳濤等[10]報(bào)道炎癥反應(yīng)與MIRI關(guān)系密切，發(fā)生MIRI時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞將釋放大量炎癥因子，如IL-6、TNF-a等；而炎癥因子會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞間粘附分子的表達(dá)，加重心肌損傷。宋維鵬等報(bào)道[11]在心臟衰竭患者血清IL-6、TNF-a水平明顯升高，且隨著患者病情的惡化，二者水平進(jìn)一步增加。血清心肌酶譜，尤其是CK-MB濃度是臨床上對(duì)心肌炎以及心肌梗死等心肌損傷性疾病的主要判定指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一定劑量的PTS能降低大鼠血清CK-MB、IL-6及TNF-α水平，提示，PTS對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用可能是通過降低心肌組織的炎性反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的。

細(xì)胞凋亡是MIRI發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)之一，凋亡的程度決定了MIRI損傷的嚴(yán)重程度。細(xì)胞凋亡基因可分為二類，第一類為前凋亡蛋白，有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，如Bax等；第二類為抗凋亡蛋白，有抗凋亡和保護(hù)細(xì)胞生存作用，通過與前凋亡蛋白結(jié)合而發(fā)生作用，如Bcl-2等，當(dāng)Bcl-2與Bax結(jié)合后，可抑制Bax誘導(dǎo)凋亡作用[12-13]。正常生理情況下，Bcl-2與Bax水平處于動(dòng)態(tài)平衡中，當(dāng)機(jī)體受到外部影響，Bcl-2與Bax平衡狀態(tài)被打破，Bax大量分泌，而體內(nèi)Bcl-2不能完全結(jié)合Bax，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PTS高劑量組和PTS中劑量組大鼠Bcl-2 mRNA水平明顯升高(P< 0.05)，而Bax mRNA水平明顯降低(P< 0.05)。這提示：PTS能調(diào)控心肌凋亡和抗凋亡關(guān)鍵酶，從而抑制心肌凋亡，減輕心肌缺血再灌注損傷。

綜上所述，本研究表明PTS預(yù)處理能減輕心肌細(xì)胞損傷，縮小心肌梗死面積，有效保護(hù)心肌缺血再灌注損傷大鼠的心肌細(xì)胞，其作用機(jī)制可能與降低大鼠血清CK-MB、IL-6及TNF-α水平，及調(diào)節(jié)凋亡和抗凋亡關(guān)鍵酶Bcl-2和Bax的表達(dá)相關(guān)。