光姣娜 魏 杰 王 洪 劉甦蘇 熊 芮 賈松華 范昌發(fā) 岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院，北京 102600)

腫瘤作為一種極大危害公眾健康的疾病，近年來引發(fā)越來越多人們的關(guān)注。腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程主要包括正常組織細(xì)胞發(fā)生突變，異常增生，形成血管，腫瘤腫塊，腫瘤遷移。由上可見，血管的形成尤為重要。血管內(nèi)皮生長因子受體-2(vascular endothelial growth factorreceptor，VEGFR-2)，又稱激酶功能區(qū)受體(KDR)在正常人體中低水平表達(dá)，而晚期腫瘤患者體內(nèi)高水平表達(dá)[1]。KDR和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)相互結(jié)合在胚胎血管形成以及血管修復(fù)方面有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，KDR的編碼基因flk-1呈雜合子類型時(shí)不會(huì)影響血管的原始循環(huán)。同時(shí)flk-1產(chǎn)生的KDR在血管形成中是必須的[2-3]。這就使hVEGFR2-KI小鼠被應(yīng)用在腫瘤研究領(lǐng)域成為可能。

實(shí)驗(yàn)小鼠的表現(xiàn)型是遺傳物質(zhì)和外部環(huán)境的共同作用結(jié)果。血液學(xué)參數(shù)能夠提供小鼠的基本背景信息，其在一定程度上反映了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的狀態(tài)[4-5]。作為重要的生物學(xué)指標(biāo)，血液學(xué)參數(shù)也是藥物反應(yīng)監(jiān)測(cè)中必須檢測(cè)的指標(biāo)[6-7]。目前還沒有hVEGFR2-KI小鼠的生物學(xué)數(shù)據(jù)報(bào)道，本研究進(jìn)行了不同周齡、性別hVEGFR2-KI小鼠的生理生化指標(biāo)測(cè)定，為相關(guān)研究應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及處理

hVEGFR2-KI小鼠由本單位自主構(gòu)建，通過將人類KDR基因敲入到C57BL/6小鼠一條染色體上構(gòu)建而成。

分別取4周齡、8周齡各20只hVEGFR2-KI小鼠雌雄各半，禁食12 h后，取20 μL靜脈血測(cè)生理指標(biāo)。全血離心后取上清測(cè)生化指標(biāo)。所有實(shí)驗(yàn)操作均按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理原則進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)證號(hào)SCXK(京)2017-0005。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用證號(hào)SYXK(京)2017-0013。

1.2 主要儀器及設(shè)備

日本光電Mek722 2血細(xì)胞分析儀，奧林巴斯AU400全自動(dòng)生化分析儀。

1.3 試劑

測(cè)生理指標(biāo)所用的清洗液DH520、清洗液DH620、稀釋液DH640、溶血?jiǎng)〥H910和溶血?jiǎng)〥H680來自上海東湖生物醫(yī)學(xué)有限公司。檢測(cè)生化指標(biāo)所用到的試劑來自中生北控生物科技股份有限公司。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法

根據(jù)說明書用日本光電Mek722 2血細(xì)胞分析儀測(cè)定紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白(MCH)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)、血紅蛋白濃度(HGB)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、紅細(xì)胞分布寬度(RDW)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、平均血小板體積(MPV)、血小板壓積(PCT)、血小板分布寬度(PDW)、淋巴細(xì)胞絕對(duì)值(LYM)、單核細(xì)胞絕對(duì)值(MON)、中性粒細(xì)胞絕對(duì)值(NEUT)、嗜酸性粒細(xì)胞絕對(duì)值(EOS)、嗜堿性粒細(xì)胞絕對(duì)值(BAS)、淋巴細(xì)胞百分率(LYM%)、單核細(xì)胞百分率(MON%)、中性粒細(xì)胞百分率(NEUT%)、嗜酸性粒細(xì)胞百分率(EOS%)和嗜堿性粒細(xì)胞百分率(BAS%)。共計(jì)22項(xiàng)指標(biāo)。

按照說明書用奧林巴斯AU400全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定總蛋白(TP)、總膽固醇(CHO)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、白蛋白(ALB)、堿性磷酸酶(ALP)、尿素(BUN)、肌酐(CREA)、葡萄糖(GLU)、磷(P)和甘油三酯(TG)，共計(jì)11項(xiàng)生化指標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 不同性別的4周齡hVEGFR2-KI小鼠血液生理生化參數(shù)的比較

在22項(xiàng)生理學(xué)指標(biāo)以及11項(xiàng)生化指標(biāo)中，RBC、HCT、MCH、MCHC共4項(xiàng)結(jié)果有極顯著差異(P<0.01)，HGB、TP、CHO共3項(xiàng)指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余各項(xiàng)之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表1。

2.2 不同性別的8周齡hVEGFR2-KI小鼠生理生化參數(shù)的比較

如表2所示，由不同性別8周齡hVEGFR2-KI小鼠的血液生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果可得，共有11項(xiàng)生理生化指標(biāo)有極顯著差異，分別是RBC、HCT、HGB、PLT、PCT、NEUT、MON%和CHO、ALP、GLU、TG；共有5項(xiàng)指標(biāo)具有顯著差異，即LYM%、NEUT%、TP、BUN和P。

2.3 不同年齡的hVEGFR2-KI小鼠之間的生理生化指標(biāo)的比較

如表3所示，4周齡和8周齡在生理生化指標(biāo)方面，有RBC、HCT、MCH、HGB、WBC、MCV、RDW、MPV、PDW、LYM、MON%、TP、CHO、ALB、ALP、CREA、GLU、P共18項(xiàng)極顯著差異指標(biāo)；以及PLT、LYM%、NEUT%、ALT、TG共5項(xiàng)具有顯著差異指標(biāo)。

3 討論

3.1 性別對(duì)于hVEGFR2-KI小鼠的影響

在檢測(cè)到的22項(xiàng)生理學(xué)指標(biāo)以及11項(xiàng)生化指標(biāo)中，從4周齡和8周齡hVEGFR2-KI小鼠不同性別之間各自比較的結(jié)果來看，4周齡小鼠雌雄之間主要是在紅細(xì)胞以及膽固醇方面有極顯著或顯著差異，涉及紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞壓積、平均紅細(xì)胞血紅蛋白及其濃度、總蛋白和總膽固醇7項(xiàng)，其余各項(xiàng)均無明顯差異。因此進(jìn)行非紅細(xì)胞或膽固醇方面研究時(shí)可考慮減少對(duì)于性別差異的關(guān)注。

而8周齡小鼠除了紅細(xì)胞方面在血小板，中性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞，淋巴細(xì)胞百分率，堿性磷酸酶，葡萄糖，甘油三脂，尿素各個(gè)方面也具有顯著差異，綜合來看，這可能提示8周齡小鼠雌雄之間的免疫情況有所差異。

表1 不同性別的4周齡hVEGFR2-KI小鼠的血液生理生化參數(shù)

表2 不同性別8周齡hVEGFR2-KI小鼠的血液生化指標(biāo)

表3 不同年齡的hVEGFR2-KI小鼠之間的生理生化指標(biāo)差異

3.2 年齡對(duì)與hVEGFR2-KI小鼠的影響

縱向來看，不同周齡的hVEGFR2-KI小鼠所測(cè)得的22項(xiàng)生理指標(biāo)和11項(xiàng)生化指標(biāo)中有18項(xiàng)具有極顯著差異，5項(xiàng)結(jié)果具有顯著差異。生理指標(biāo)中除了平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度以及血小板壓積這兩項(xiàng)外均有極顯著或顯著差異；各項(xiàng)免疫細(xì)胞的指標(biāo)中淋巴細(xì)胞的絕對(duì)值和單核細(xì)胞的百分率有顯著性差異，淋巴細(xì)胞的百分率、中性粒細(xì)胞百分率這2項(xiàng)結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。生化指標(biāo)中差異范圍更大，除尿素和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶之外其余各項(xiàng)指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這其中除了甘油三酯之外都有顯著性差異。綜合來看，不同年齡的hVEGFR2-KI小鼠之間生理生化上具有明顯的差異。在平行實(shí)驗(yàn)中宜選取相同年齡段小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.3 hVEGFR2-KI小鼠的選擇特性

形成血管是腫瘤的發(fā)生發(fā)展中必不可少的一部分，已有研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體內(nèi)的VEGF和KDR相結(jié)合，在后期的血管形成和血管修復(fù)中有重要作用，并且以KDR為靶點(diǎn)治療癌癥[8-10]。用到KDR基因敲除小鼠自然不可避免，而純合的KDR敲除小鼠的成活率很低。因此我們檢測(cè)hVEGFR2-KI小鼠的血液生理生化指標(biāo)，并分析了年齡和性別對(duì)于該品系小鼠的影響。發(fā)現(xiàn)4周齡hVEGFR2-KI小鼠雌雄之間差距相對(duì)較小，主要集中在紅細(xì)胞和膽固醇方面。8周齡hVEGFR2-KI雌雄小鼠差異相對(duì)明顯，在免疫方面也有顯著差異。不同周齡小鼠生理生化的很多方面都有極顯著或顯著差異。本研究所提供hVEGFR2-KI小鼠的生理生化數(shù)據(jù)，為科研工作者進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究選擇動(dòng)物方面提供一定參考。