蒙艷麗 徐慧星 王曉溪 宋亞娟 蔡蕭君 王偉明

(黑龍江省中醫(yī)藥科學院， 哈爾濱 150036)

肺炎支原體肺炎(MPP)屬于間質性肺炎，是肺炎支原體(MP)引起的以肺間質纖維結締組織增生為主要病理改變的呼吸道感染性肺炎。慢性肺部疾病和免疫力低下人群對肺炎支原體易感，MPP占成年人肺炎的20%，兒童可達到40%[1]。肺炎支原體經呼吸道侵入后主要侵犯細支氣管和支氣管周圍組織小葉間和肺泡間隔的結締組織，慢性肺部炎癥導致病變反復遷延，細胞外基質(ECM)的反復破壞、修復、重建和過度沉積而致間質纖維化，病理改變有間質性病變改變，多見斑片影、片狀密度增高影，雙肺均可受累[2]。

考慮到臨床肺炎支原體易感于慢性支氣管炎癥患者，結合臨床病因，建立慢性肺部炎癥合并肺炎支原體肺炎實驗動物模型[3]。首先使用煙霧對支氣管黏膜進行刺激，經過反復刺激呼吸道，黏膜和纖毛損害，建立慢性肺部炎癥模型[4-6]。損害的黏膜和纖毛易于肺炎支原體入侵，再通過給小鼠滴鼻肺炎支原體，建立肺炎支原體肺炎模型[7-8]。兩種模型結合將建立一種新型肺部慢性炎癥合并肺炎支原體肺炎模型，為后續(xù)的中藥制劑芩百清肺濃縮丸等療效提高和深度開發(fā)提供理論和實驗根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

肺炎支原體標準株(ATCC 15531)購自American Type Culture Collection，培養(yǎng)在胎牛血清中24 h后，放于含20%胎牛血清，10%酵母的PPLO培養(yǎng)基中生長，每隔7 d傳代一次。

1.2 動物

100只BALB/c小鼠，體質量18～22 g，雌雄各半，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號SCXK(京)2015-0001。

1.3 主要試劑

PPLO 培養(yǎng)基 (Becton，Dickinson and Company，USA);酵母(安琪酵母股份有限公司);胎牛血清(Gibco，USA);蘇木素、伊紅染液(南京建成公司);Masson 三色染色試劑盒(Solarbio);TRIzol試劑(美國Invitrogen);One-step RT-PCR kit(Promega);肺炎支原體核酸定量檢測試劑盒(中國達安基因)。

1.4 主要儀器設備

KD-TS3A自動組織脫水機(浙江金華科迪儀器設備有限公司)；KD-BM生物組織包埋機(浙江金華科迪儀器設備有限公司)；RM2235組織切片機(德國萊卡)；BX4-1生物顯微鏡(OLYMPUS公司)；Infinite M200 型多功能酶標儀(瑞士TECAN公司)；9 600 熒光定量PCR儀(杭州博日有限公司)；MDF-382E -80 ℃低溫冰箱(日本SANYO公司)；ST-16R型低溫高速離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)；LXJ-n型普通低速離心機(上海醫(yī)用分析儀器廠)20 μL、200 μL、1 000 μL微量加樣器(Eppendoff 公司)；BP211D分析天平(Sartorius公司)。

1.5 方法

1.5.1動物模型建立：30只20～22 g的BALB/c小鼠，隨機分為3組，煙熏并感染組(煙熏并肺炎支原體感染)10只，感染組(肺炎支原體感染)10只，空白組10只。煙熏并感染組小鼠使用國家發(fā)明專利儀器嚙齒類動物呼吸系統(tǒng)暴露染毒裝置煙熏10 d，每天2次，每次30 min。10 d后煙熏并感染組和感染組小鼠乙醚麻醉，移液槍吸取20 μL 106CCU/mL肺炎支原體液，抓取小鼠通過小鼠自然吸氣鼻吸入液體，連續(xù)3 d。空白組則吸入同體積的MP液體培養(yǎng)基。結束后將小鼠斷髓處死，分離肺組織，左肺組織10%甲醛固定，用于HE染色、右肺組織進行支原體檢測Realtime PCR實驗。實驗重復3次。

1.5.2Realtime PCR：應用肺炎支原體核酸定量檢測試劑盒進行肺炎支原體基因拷貝數(shù)測定，參照張越華和鄭秀青文獻優(yōu)化實驗條件[9]。各組肺組織勻漿后，吸取10 uL勻漿液，再加入等量DNA 提取液充分混勻，在100 ℃恒溫處理10 min；12 000 r/min離心5 min，取上清備用。取PCR 反應管，加入處理后的樣品、陰性質控品、MP弱陽性、MP強陽性質控品及不同濃度的MP陽性定量參考品上清液2 μL，8 000 r/min離心數(shù)秒，放入PCR儀器樣品槽。按對應順序設置位置，循環(huán)條件設置：93 ℃ 2 min； 93 ℃ 45 s，55 ℃ 60 s，10個循環(huán)；93 ℃ 30 s,55 ℃ 45 s，30個循環(huán)。有效檢測劑量為>103基因拷貝/mL。

1.5.3HE染色：檢測組織結構改變的最常規(guī)方法。肺組織放于10%甲醛中固定48 h以上，脫水、透明、包埋、切片、脫蠟、水化后，用蘇木素和伊紅染色，脫水，中性樹膠進行封片。肺組織切片HE染色，細胞核被染成藍色，細胞質、結締組織和肌肉等均被染成不同程度的紅色，在光學顯微鏡下觀察肺組織病理的變化。病理評分為0(沒有改變)～16(最大改變)，按毛細支氣管炎、血管周圍炎、間質性肺炎和肺泡炎從輕到重定為1～4分。

1.5.4Masson染色：Masson染色是結締組織染色最經典的一種方法，主要用于顯示組織中纖維。肺組織放于10%甲醛中固定48 h以上，脫水、透明、包埋、石蠟切片脫蠟，蘇木精染液5～10 min，充分水洗，鹽酸酒精分化，Masson 麗春紅酸性復紅液5～10 min，2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，1%磷鉬酸水溶液分化3～5 min，直接用苯胺藍液染5 min，以0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，95%酒精、無水酒精、二甲苯透明、中性樹膠封固。

1.6 統(tǒng)計方法

統(tǒng)計分析為單因素方差分析方法分析組間差異，相關數(shù)據(jù)用“均數(shù)±標準差”表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，顯著差異P<0.05。實驗重復3次，每次實驗取平均值，三次重復平均值結果進行統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 肺炎支原體基因拷貝數(shù)測定

實驗使用肺炎支原體核酸定量檢測試劑盒，檢測肺上清液中的肺炎支原體DNA,見表1。大于103基因拷貝/mL為有效檢測劑量，重復3次實驗PCR結果統(tǒng)計看出，煙熏并感染組小鼠肺炎支原體感染率為93%，高于感染組77%；空白組小鼠感染率為0%，見圖1。結果證明與空白組比較，煙熏并感染組和感染組均有顯著性差異，P<0.05。煙熏并感染組優(yōu)于感染組。

2.2 肺組織病理檢查

HE染色顯示空白組小鼠肺組織形態(tài)無異常改變，結構清楚，肺泡腔完整，排列規(guī)則，無炎細胞浸潤。感染組小鼠肺組織上皮細胞脫落，支氣管間隙增厚，肺泡壁毛細血管中有過量的紅細胞，肺泡壁與間隔有大量炎性細胞浸潤，肺泡壁塌陷，可發(fā)生灶性肺不張。煙熏并感染組小鼠肺組織細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，表現(xiàn)為肺泡壁明顯增厚，塌陷嚴重，肺泡腔排列不規(guī)則，部分肺泡腔閉塞使肺組織呈片狀密度增高的致密結構，與正常肺組織的分界非常明顯，有些肺組織充斥大量紅細胞，見圖2A。

表1 空白組、感染組、煙熏并感染組小鼠肺炎支原體基因拷貝數(shù)

圖1 空白組、感染組、煙熏并感染組小鼠肺炎支原體感染率

圖2 空白組、感染組、煙熏并感染組小鼠病理HE染色及評分結果 (×200)

從3次重復實驗病理評分可知，煙熏并感染組在毛細支氣管炎、血管周圍炎、間質性肺炎和肺泡炎等癥狀上較感染組損傷嚴重。與空白組比較，煙熏并感染組和感染組均有顯著差異，見圖2B。(P<0.05。)

2.3 肺組織纖維化實驗

小鼠肺組織Masson染色表明，空白組小鼠肺組織無或極少有膠原纖維形成，肺結構清晰可見，排列規(guī)則；感染組小鼠肺組織的小葉間質以及血管周圍、細支氣管周圍有大量藍染的膠原纖維，呈現(xiàn)細絲狀；煙熏并感染組小鼠藍色區(qū)域即膠原纖維明顯增多呈現(xiàn)帶狀，實驗重復3次。見圖3。

圖3 空白組、感染組、煙熏并感染組小鼠病理Masson染色結果 (×200)

3 討論

藥物臨床前研究是新藥研發(fā)的重要階段,是評價藥物有效性和安全性的基礎工作,臨床前研究結果的準確性和可靠性,是保證藥物研發(fā)成功和降低臨床研究風險的重要措施。藥物的臨床前研究主要是指使用非人類模式生物或實驗動物進行的研究,通過不同的動物模型和實驗方法,評價藥物的藥效。實驗動物模型是研究的最常用的方法，能為我們解析重大人類疾病機理,發(fā)現(xiàn)新藥作用靶點和新型藥物的創(chuàng)制。目前沒有慢性肺部炎癥合并肺炎支原體肺炎模型建立方法的報道，參照以往肺損傷動物模型[10]及鼻滴入感染方法建立肺炎支原體肺炎動物模型[11-12]，考慮到肺炎支原體的感染特點即易感于慢性肺部炎癥人群[13]，本論文改進動物造模方法，模擬臨床病因建立慢性肺部炎癥合并肺炎支原體肺炎模型[14-15]。

煙霧對支氣管黏膜反復刺激，損害黏膜和纖毛，易于肺炎支原體黏附，加重肺炎支原體肺炎。實驗結果表明，支原體檢測試劑盒檢測，發(fā)現(xiàn)煙熏并感染組小鼠的支原體感染率明顯高于正常感染組；通過HE染色，煙熏并感染組小鼠肺組織病理圖片的細胞狀態(tài)、輪廓、炎癥變化都要比正常感染組的嚴重，表明煙熏并感染組小鼠的感染明顯加重。Masson染色圖片顯示，煙熏并感染組小鼠膠原纖維大量增加，呈現(xiàn)寬帶狀或片狀，其病變程度明顯高于感染組。實驗結果證明，煙熏并感染組小鼠與感染組小鼠比較，肺組織結構損壞嚴重，間質膠原纖維生成更加明顯，肺炎支原體更加易感，這可能是慢性肺部炎癥患者易于合并肺炎支原體肺炎，并反復遷延不愈原因。