亓馨怡，侯冰玉，李建科，姚霄月，黃晶晶，李臣貴

UHPLC-MS/MS法測(cè)定氟苯尼考明膠納米藥物在小鼠體內(nèi)的血藥濃度

亓馨怡，侯冰玉，李建科，姚霄月，黃晶晶，李臣貴*

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/動(dòng)物醫(yī)學(xué)院山東 泰安 271018）

為了建立一種測(cè)定氟苯尼考明膠納米藥物在小鼠體內(nèi)血藥濃度的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UHPLC-MS/MS）方法。采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)比法，以甲砜霉素為內(nèi)標(biāo)，利用乙酸乙酯提取血漿中的藥物，優(yōu)化色譜質(zhì)譜條件，建立了測(cè)定氟苯尼考明膠納米在小鼠血液中濃度的方法。結(jié)果表明，方法特異性良好，氟苯尼考在6.17~789.6 ng·mL-1內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，提取回收率、準(zhǔn)確度、精密度和穩(wěn)定性均符合要求。本試驗(yàn)建立了一個(gè)專(zhuān)屬性強(qiáng)，靈敏度高，重現(xiàn)性好的UHPLC-MS/MS方法，能夠準(zhǔn)確的測(cè)定氟苯尼考明膠納米藥物在小鼠體內(nèi)的血藥濃度。

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；氟苯尼考明膠納米藥物；體內(nèi)藥物分析；小鼠

氟苯尼考為美國(guó)先靈葆雅公司1988年研制，我國(guó)1999年批準(zhǔn)在中國(guó)上市的一種獸用氯霉素類(lèi)抗生素，廣泛應(yīng)用于敏感菌所致的畜禽及魚(yú)類(lèi)疾病的防治[1-2]，作為一種動(dòng)物專(zhuān)用廣譜抗生素，在動(dòng)物細(xì)菌性傳染疾病的防治中具有巨大的應(yīng)用前景[3]。但氟苯尼考在水溶液中幾乎不溶解[4-6]，大大限制了在獸醫(yī)臨床中的應(yīng)用。前期筆者制備了新型氟苯尼考明膠納米藥物，提高了氟苯尼考溶解性，增加了其在體外的緩釋性能。但尚未建立體內(nèi)分析方法，無(wú)法研究其在體內(nèi)的釋放行為。本實(shí)驗(yàn)旨在建立測(cè)定小鼠體內(nèi)氟苯尼考明膠納米藥物血藥濃度的方法，為研究氟苯尼考納米藥物在小鼠體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)提供方法和支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（雙高壓泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、電噴霧離子化接口、三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器）、色譜工作站、高速離心機(jī)（1612–1型，上海醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司）、便攜式樣品濃縮儀（PRO-12L Plus，南京利昭儀器設(shè)備有限公司）、超純水機(jī)（威立雅水處理技術(shù)(上海)有限公司）、渦旋振蕩儀（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.1.2 藥品 氟苯尼考（藥用對(duì)照品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、甲砜霉素（99.5 %，MACKLIN）、乙腈（色譜純，SIGMA-ALORICH）、乙酸乙酯（分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）、甲醇（色譜純，SIGMA-ALORICH）、氟苯尼考明膠納米藥物（實(shí)驗(yàn)室自制）。

1.1.3 供試動(dòng)物 昆明小鼠（濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育中心）。

1.2 方法

1.2.1 液相色譜與質(zhì)譜條件 （1）色譜條件：色譜柱 AccucoreTM C18柱（2.1×100 mm，2.6 μm)；流動(dòng)相甲醇-水（50:50）；流速0.2 ml/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量3 μl。（2）質(zhì)譜條件：離子化方式HESI；離子檢測(cè)方式SRM；掃描方式：負(fù)離子掃描；電噴霧電壓2700V；鞘氣40 Arb；輔助氣1 Arb；離子傳輸管溫度300 ℃；熱噴霧溫度275 ℃。檢測(cè)離子對(duì)：氟苯尼考（356.152/335.9），甲砜霉素（354.129/ 184.9）。

1.2.2 試劑配制 （1）氟苯尼考儲(chǔ)備液：精密稱(chēng)取氟苯尼考對(duì)照品9.87 mg，置于25 ml量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得394.8 μg/ml氟苯尼考的儲(chǔ)備液。（2）甲砜霉素（內(nèi)標(biāo)）儲(chǔ)備液：精密稱(chēng)取甲砜霉素對(duì)照品10.85 mg，置于25 ml量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得434.0 μg/ml甲砜霉素的儲(chǔ)備液。（3）氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)添加溶液：取儲(chǔ)備液0.05 ml置于10 ml量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得1.974 μg/ml氟苯尼考甲醇溶液。（4）甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)添加液：取儲(chǔ)備液0.05 ml置于10 ml量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得2.17 μg/ml甲砜霉素甲醇溶液，依次稀釋?zhuān)涑?17 ng/ml的甲砜霉素甲醇對(duì)照品溶液。（5）氟苯尼考線(xiàn)性溶液：取氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)添加液，依次稀釋?zhuān)涑?89.6、394.8、197.4、98.7、49.35、24.68、12.34、6.17 ng/ml的氟苯尼考甲醇對(duì)照品溶液。

1.2.3 血漿樣品預(yù)處理 精密量取血漿20 μl至2 ml具塞離心管，加入100 μl甲砜霉素內(nèi)標(biāo)渦旋3 min，加入乙酸乙酯500 μl，渦旋5 min，6 000 r/min離心5 min，吸取上清液至另一離心管，下層濁液加入500 μl乙酸乙酯渦旋5 min重提一次，合并提取液，氮?dú)獯蹈伞＜尤?00 μl甲醇渦旋3 min復(fù)溶，加入500 μl水，渦旋3 min，0.22 μm濾膜過(guò)濾后取3 μl進(jìn)樣檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜特異性

分別取氟苯尼考和甲砜霉素溶液加入小鼠血漿中，按“血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)處理后進(jìn)樣，記錄色譜質(zhì)譜圖，結(jié)果顯示在本試驗(yàn)條件下，氟苯尼在3.60 min左右出峰，內(nèi)標(biāo)甲砜霉素保留時(shí)間在3.14 min左右，空白血漿無(wú)雜峰干擾測(cè)定，氟苯尼考與甲砜霉素分離良好?？梢?jiàn)本方法具有較高的特異性，能準(zhǔn)確測(cè)定血漿中氟苯尼考與甲砜霉素的濃度。

2.2 回收率

2.3 線(xiàn)性及線(xiàn)性范圍

取離心管數(shù)支，分別精密加入不同量的氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)液，吹干后加入空白血漿20 ml，旋渦30 s混勻，配成氟苯尼考濃度分別為789.6、394.8、197.4、98.7、49.35、24.68、12.34、6.17 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，按“血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)操作，記錄色譜圖，計(jì)算待測(cè)物的峰面積As與內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值?，以比值?（?=As/Ai）對(duì)待測(cè)物濃度C作回歸計(jì)算。計(jì)算待測(cè)物的峰面積As與內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值?，以比值?（?=As/Ai）對(duì)待測(cè)物濃度C作回歸計(jì)算，得回歸方程?=0.0197×C+0.0052，r2= 0.9994，權(quán)重系數(shù)w=1/C2。結(jié)果顯示氟苯尼考血藥濃度在6.17-789.6 ng/ml范圍內(nèi)，?與C線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.4 精密度和準(zhǔn)確度

（1）取2 ml塑料離心管數(shù)支，精密加入不同量的各對(duì)照品溶液，以氮?dú)饬鞔蹈?，加?0 μl空白小鼠血漿，旋渦30 s混勻，配成氟苯尼考濃度分別為6.17、98.7、789.6 ng·mL–1的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，按照“血漿樣品預(yù)處理”操作。共做三批，每批隨行一條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，每批每個(gè)濃度做5份樣品。記錄色譜圖，計(jì)算待測(cè)物的峰面積As與內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值?，分別將f代入當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得實(shí)測(cè)濃度，計(jì)算批內(nèi)和批間精密度。由表1所示，批內(nèi)和批間精密度均符合要求。（2）取精密度測(cè)得濃度與加入濃度比較，計(jì)算相對(duì)準(zhǔn)確度及RSD，結(jié)果如表2所示，測(cè)定平均相對(duì)準(zhǔn)確度為98.9 %，RSD=1.9 %，符合要求。

表1 小鼠血漿中氟苯尼考的批內(nèi)和批間精密度

表2 小鼠血漿中氟苯尼考的準(zhǔn)確度測(cè)定結(jié)果

2.5 小鼠血漿樣品中氟苯尼考的穩(wěn)定性

（1）取離心管數(shù)支，精密加入不同量的氟苯尼考對(duì)照品溶液，吹干后加入50 μl空白血漿，旋渦30 s混勻，配成濃度分別為6.17、98.7、789.6 ng·mL–1的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，每個(gè)濃度各做若干份樣品。（2）1份于配制好后按“血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)操作后，于不同時(shí)間進(jìn)行LC–MS/MS分析，記錄色譜圖和峰面積，計(jì)算待測(cè)物的峰面積As與內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值?，考察樣品溶液的穩(wěn)定性。（3）凍融穩(wěn)定性檢測(cè)：3份于配制好后按“血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)操作后立即提取分析，記錄色譜圖和峰面積，計(jì)算待測(cè)物的峰面積As與內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值?，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得實(shí)測(cè)濃度計(jì)算實(shí)測(cè)濃度平均值，此為立即測(cè)定樣品；3份于配制好后放入冰箱于 –20 ℃ 冰凍后取出化凍，反復(fù)凍融3次后按“血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)操作提取分析，記錄色譜圖和峰面積，計(jì)算待測(cè)物的峰面積As與內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值?，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得實(shí)測(cè)濃度計(jì)算實(shí)測(cè)濃度平均值，與立即測(cè)定樣品的對(duì)應(yīng)實(shí)測(cè)濃度相比，考察凍融穩(wěn)定性。由表3可知，3個(gè)濃度在4 h內(nèi)，待測(cè)物的峰面積As與內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值?的RSD均小于10 %，表明4 h內(nèi)樣品溶液穩(wěn)定性良好。由表4可知，氟苯尼考3個(gè)濃度在反復(fù)凍融3次后與立即測(cè)定樣品的實(shí)測(cè)濃度的比值在97 % ~101 % 之間，表明反復(fù)凍融3次后樣品穩(wěn)定性良好。

表3 樣品溶液穩(wěn)定性 (?=As/Ai)

表4 凍融穩(wěn)定性 (ni=3)

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了測(cè)定小鼠血漿中氟苯尼考的LC–MS/MS法，測(cè)定條件下小鼠血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測(cè)物及內(nèi)標(biāo)的測(cè)定，提取回收率均大于85 %。氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性范圍6.17~ 789.6 ng/ml，線(xiàn)性關(guān)系良好；高、中、低三種濃度的批內(nèi)、批間精密度RSD均小于10 %，準(zhǔn)確度為95.6 %～101.1 %；氟苯尼考血漿樣品在室溫下放置4 h、反復(fù)凍融3次條件下穩(wěn)定性良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所建立方法樣品處理時(shí)間短，方法重現(xiàn)性、專(zhuān)屬性好，可用于氟苯尼考在小鼠體內(nèi)的血藥濃度分析。

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國(guó)家自然科學(xué)基金（31602111）；中國(guó)博士后基金（2017M612314）；山東省重大科技創(chuàng)新工程（2019JZZY010735）；山東省“雙一流學(xué)科”和大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201910434022）

*通訊作者

（2020–10–19）

S851.34

A

1007-1733（2021）01-0007-04