保紅云，孫仁弟，邱明豐

（1.上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200000；2.上海綠谷生命園醫(yī)藥有限公司，上海 200000）

丹酚酸B是中藥丹參的主要成分，具有抗腫瘤，保護(hù)心腦血管等作用。丹酚酸B的富集和純化主要由大孔吸附樹(shù)脂純化工序進(jìn)行操作，丹酚酸B目前采用手動(dòng)操作進(jìn)行富集，難以避免因手動(dòng)操作控制不準(zhǔn)確而引起的產(chǎn)品質(zhì)量差異。本課題的主要研究?jī)?nèi)容為：通過(guò)建立丹酚酸B純化工藝自動(dòng)化生產(chǎn)線，制定純化過(guò)程標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，嚴(yán)格控制產(chǎn)品純化過(guò)程[1]，提高丹酚酸B純化工藝批間質(zhì)量穩(wěn)定一致性、產(chǎn)品轉(zhuǎn)移率[2]和成品丹酚酸B含量。

1 儀器、試劑與材料

AB135-S電子天平（梅特勒-托利多）；FA1004N型天子天平（上海天平儀器廠）；1200型高效液相色譜儀（安捷倫）。

甲醇為色譜純；水為純化水；磷酸為分析純；丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)品。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 自控程序

吸附柱是利用D-101大孔吸附樹(shù)脂的特殊結(jié)構(gòu)，通過(guò)D-101大孔吸附樹(shù)脂巨大的比表面進(jìn)行物理吸附，用不同的溶劑將吸附物質(zhì)洗脫下來(lái)，從而達(dá)到有效成分分離、純化的目的[3][4]。自控程序是通過(guò)控制工序段中各個(gè)設(shè)備運(yùn)行的動(dòng)作并檢測(cè)記錄其狀態(tài)，綜合協(xié)調(diào)最優(yōu)化工序段的生產(chǎn)控制參數(shù)[5]。嚴(yán)格遵守規(guī)范可靠性、技術(shù)先進(jìn)合理性、模塊化、開(kāi)放性和安全性5大原則[6]，保證中藥生產(chǎn)工藝的每個(gè)參數(shù)和具體操作過(guò)程得到科學(xué)有效地監(jiān)控，達(dá)到中藥生產(chǎn)的自動(dòng)化[7]。

藥液進(jìn)柱控制：根據(jù)工藝需要選擇吸附柱組別，通過(guò)對(duì)藥液高位罐出液閥控制實(shí)現(xiàn)藥液自動(dòng)進(jìn)柱，采用變頻輸液泵自動(dòng)控制每根樹(shù)脂柱的進(jìn)液速度，實(shí)現(xiàn)進(jìn)柱藥液量的自動(dòng)控制，同時(shí)結(jié)合出液流量計(jì)、調(diào)節(jié)閥控制出液速度。

柱液位控制：系統(tǒng)自動(dòng)檢測(cè)柱內(nèi)液位，出現(xiàn)液位低位時(shí)自動(dòng)報(bào)警。

有機(jī)溶媒洗脫控制：通過(guò)對(duì)洗脫溶媒罐自動(dòng)出液閥及變頻輸液泵的控制實(shí)現(xiàn)不同洗脫階段洗脫溶媒的自動(dòng)進(jìn)柱洗脫過(guò)程，結(jié)合出液流量計(jì)及出液調(diào)節(jié)閥控制洗脫速度。

洗脫液收集控制：根據(jù)洗脫過(guò)程不同階段自動(dòng)切換廢液及洗脫收集罐，并且在出液完成后自動(dòng)完成清洗。[8][9]

2.2 丹酚酸B洗脫液

2.2.1 樣品溶液的制備

供試品溶液的制備：取本品用流動(dòng)相稀釋7.5倍。

2.2.2 丹酚酸B的測(cè)定

2.2.2.1 色譜條件

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-5mmol/L磷酸二氫鉀（30:70）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為290nm；柱溫24℃，流速為1.0ml/min，進(jìn)樣量為3ul，理論塔板數(shù)按丹酚酸B計(jì)不低于700。[10]

根據(jù)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，在此檢測(cè)條件下，丹酚酸B純度＞80%，峰面積＞500mAU*s為合格洗脫液 。

2.3 丹酚酸B成品

2.3.1 樣品溶液的制備

2.3.1.1 對(duì)照品溶液的制備

取丹酚酸B對(duì)照品15mg，精密稱定，置50m1量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取2ml，置20ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得[11]。

2.3.1.2 供試品溶液的制備

取本品20mg，精密稱定，置50m1量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取2ml，置20ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.3.2 丹酚酸B的測(cè)定

2.3.2.1 色譜條件

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-5mmol/L磷酸二氫鉀（30:70）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為290nm；柱溫24℃，流速為1.0ml/min，理論塔板數(shù)按丹酚酸B峰計(jì)應(yīng)不低于1500，丹酚酸B峰與相鄰峰的分離度應(yīng)大于2.0[12]。

根據(jù)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，在此檢測(cè)條件下，按無(wú)水物計(jì)算，本品中丹酚酸B含量應(yīng)為80.0～90.0%。

2.4 手動(dòng)和自動(dòng)操作丹酚酸B洗脫液的對(duì)比研究

2.4.1 手動(dòng)和自動(dòng)操作丹酚酸B洗脫液轉(zhuǎn)移率對(duì)比研究

分別收集3批次的手動(dòng)操作和自動(dòng)操作的丹酚酸B洗脫液，取樣檢測(cè)洗脫液峰面積，計(jì)算并對(duì)比原手動(dòng)操作方法與現(xiàn)自動(dòng)化控制操作方法進(jìn)行洗脫的洗脫液的轉(zhuǎn)移率[13]。

丹參多酚酸20%乙醇洗脫液轉(zhuǎn)移率計(jì)算公式：

理論產(chǎn)量：M標(biāo)*C標(biāo)*A樣*V樣*樣品稀釋倍數(shù)/A標(biāo)/V標(biāo)（式1）

轉(zhuǎn)移率：本工序理論產(chǎn)量/上一工序理論產(chǎn)量×100%（式2）

注：A樣、A標(biāo)為樣品、標(biāo)準(zhǔn)品峰面積；V樣、V標(biāo)分別為樣品、標(biāo)準(zhǔn)品體積（L）；C標(biāo)%為標(biāo)準(zhǔn)品含量（%）；M標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品稱重。

2.4.2 手動(dòng)操作和自動(dòng)操作丹酚酸B洗脫液量批次穩(wěn)定一致性對(duì)比研究

分別收集20批次的手動(dòng)操作和自動(dòng)操作的丹酚酸B洗脫液，每批取樣10mL，檢測(cè)含量，通過(guò)計(jì)算CPK（過(guò)程能力指數(shù)Process capability index）進(jìn)行對(duì)比手動(dòng)操作和自動(dòng)操作的批次穩(wěn)定一致性[14]。

CPK= Min[ （USL- Mu）/3σ, （Mu - LSL）/3σ]（式3）

注：USL為標(biāo)準(zhǔn)上限，LSL為標(biāo)準(zhǔn)下限，Mu為平均值，σ為標(biāo)準(zhǔn)差。

2.4.3 手動(dòng)操作和自動(dòng)操作的丹酚酸B成品含量對(duì)比研究

分別收集20批次的手動(dòng)操作和自動(dòng)操作的丹酚酸B成品作為供試品。分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10ul，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算丹酚酸B含量。

按無(wú)水物計(jì)算，本品中丹酚酸B含量應(yīng)為80.0～90.0%

注：A對(duì)為對(duì)照品峰面積；W樣、W對(duì)分別為供試品、對(duì)照品稱重（mg）；C對(duì)%為對(duì)照品含量（%）

3 結(jié) 果

3.1 手動(dòng)操作和自動(dòng)操作丹酚酸B洗脫液的對(duì)比研究

3.1.1 手動(dòng)操作和自動(dòng)操作丹酚酸B洗脫液轉(zhuǎn)移率對(duì)比研究

手動(dòng)操作和自動(dòng)操作的丹酚酸B轉(zhuǎn)移率對(duì)比結(jié)果表明，手動(dòng)操作的三個(gè)批號(hào)轉(zhuǎn)移率分別是69.08%、69.53%、69.89%；自動(dòng)操作的三個(gè)批號(hào)轉(zhuǎn)移率分別是73.99%、73.96%、73.82%。綜合比較原手動(dòng)操作方法與現(xiàn)自動(dòng)化控制操作方法的在吸附洗脫工序轉(zhuǎn)移率明顯平均上升。手動(dòng)操作和自動(dòng)操作丹酚酸B洗脫液轉(zhuǎn)移率比較見(jiàn)表1。

表1 手動(dòng)操作和自動(dòng)操作丹酚酸B洗脫液轉(zhuǎn)移率比較

3.1.2 手動(dòng)操作和自動(dòng)操作丹酚酸B洗脫液批次穩(wěn)定均一性對(duì)比研究

通過(guò)對(duì)20批次手動(dòng)操作和自動(dòng)操作控制丹酚酸B洗脫液CPK比較，自動(dòng)控制和手動(dòng)控制CPK分別為1.63、1.58，可見(jiàn)他們的過(guò)程能力都是比較良好，自動(dòng)CPK值較高，表明自動(dòng)操作丹酚酸B洗脫液量離散程度相對(duì)于技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的公差范圍較小，因而過(guò)程能力和批間一致性較高[15]。20批次手動(dòng)操作和自動(dòng)操作丹酚酸B洗脫液量趨勢(shì)見(jiàn)圖1。

圖1 20批次手動(dòng)操作和自動(dòng)操作丹酚酸B洗脫液量趨勢(shì)圖

3.1.3 手動(dòng)操作和自動(dòng)操作成品含量對(duì)比研究

20批次自動(dòng)控制和手動(dòng)控制成品丹酚酸B平均含量分別為81.71%和81.22%。綜合比較自動(dòng)化操作相較于手動(dòng)平均成品丹酚酸B含量較高。20批次手動(dòng)操作和自動(dòng)操作丹酚酸B成品含量對(duì)比見(jiàn)圖2。

4 結(jié)論與討論

4.1 結(jié)論

從自控化操作和手動(dòng)操作的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，純化工序自動(dòng)化操作的轉(zhuǎn)移率、批間穩(wěn)定一致性以及丹酚酸B成品含量要優(yōu)于手動(dòng)操作。

4.2 討論

吸附柱收集洗脫液是以HPLC的檢驗(yàn)結(jié)果來(lái)判定的，在收集洗脫液過(guò)程不能實(shí)現(xiàn)全過(guò)程的自動(dòng)化控制，需要人工干預(yù)進(jìn)行選擇。近些年來(lái)，近紅外光譜法在國(guó)內(nèi)的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，在中藥提取、濃縮、純化等過(guò)程均有應(yīng)用[16]。因此在后續(xù)設(shè)備改造過(guò)程中可以應(yīng)用近紅外方法來(lái)提高吸附柱的整體自動(dòng)化控制水平，提升產(chǎn)品質(zhì)量。

圖2 20批次手動(dòng)操作和自動(dòng)操作丹酚酸B成品含量對(duì)比圖