高兆建，王秋芬，丁飛鴻，許 祥，趙宜峰，焦 魏，陳 騰,*

（1.徐州工程學(xué)院食品（生物）工程學(xué)院，江蘇 徐州 221018；2.海濱林場(chǎng)，河北 秦皇島 066100；3.長(zhǎng)江桂柳食品睢寧有限公司，江蘇 徐州 221000；4.邳州市金大地肥料有限公司，江蘇 徐州 221300）

近年來，化學(xué)農(nóng)藥和傳統(tǒng)抗生素及防腐劑過量使用帶來的食品安全、環(huán)境問題以及細(xì)菌耐藥性問題越來越受關(guān)注[1]。對(duì)病原菌具有顯著抗性的脂肽類抗生素成為人們研究的焦點(diǎn)。芽孢桿菌屬的細(xì)菌自然界中分布廣泛，具有極強(qiáng)的抗逆能力，生長(zhǎng)代謝過程中能產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)[2]，如抗菌蛋白、抗菌脂肽和揮發(fā)性抑菌物質(zhì)等，其中部分環(huán)脂肽類抑菌物質(zhì)具有較好的抗菌活性，它是芽孢桿菌通過非核糖體合成途徑產(chǎn)生的具有抗菌作用的脂肽類化合物，主要包括表面活性素（Surfactin），伊枯草菌素（Iturin）和芬芥素（Fengycin）3大類[3]。這些脂肽類物質(zhì)由脂肪酸鏈和肽環(huán)兩部分構(gòu)成，7 個(gè)（Surfactin和Iturin）或10 個(gè)（Fengycin）α-氨基酸鏈接到一個(gè)獨(dú)特的β-氨基（Iturin）或β-羥基（Surfactin，F(xiàn)engycin）脂肪酸鏈上[3]。這種脂肪酸鏈的長(zhǎng)度不一，Surfactin為C13～C16，Iturin為C14～C17，F(xiàn)engycin為C14～C18[4]。其特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)賦予這些脂肽類抗菌物質(zhì)具備抗細(xì)菌、抗真菌[5]、抗腫瘤、抗病毒[6]、抗支原體、溶血栓等功能，其廣譜、高效、低毒、耐熱、耐酸、對(duì)蛋白酶穩(wěn)定[7]、不易產(chǎn)生耐藥性、易被生物降解等優(yōu)勢(shì)使得其在農(nóng)業(yè)[8]、食品[9]、醫(yī)藥、化妝品、環(huán)保[10]、畜牧業(yè)等[11]領(lǐng)域備受關(guān)注[12-13]。因此，繼續(xù)挖掘新型高效的脂肽類物質(zhì)，使其充分發(fā)揮其多元化的功能，具有重要的科學(xué)意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

目前，很多研究者致力于芽孢桿菌產(chǎn)生脂肽的研究，已經(jīng)從植物、土壤、海洋等各種環(huán)境中連續(xù)篩選出新的產(chǎn)脂肽菌株[14]，并從其發(fā)酵液中分離出不同結(jié)構(gòu)類型的脂肽化合物。Aktuganov等[15]從愛媛類芽孢桿菌IB-X-b發(fā)酵液中鑒定了1 種Fengycin同系物，對(duì)麥根腐德氏霉（Drechslera sorokiniana）具有很強(qiáng)的抑菌作用；Cao Yun等[16]發(fā)現(xiàn)生防枯草芽孢桿菌SQR 9對(duì)抑制尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）導(dǎo)致的黃瓜枯萎病有顯著效果，并通過高效液相色譜和質(zhì)譜技術(shù)從其發(fā)酵液中檢測(cè)到Fengycin和Bacillomycin。Hentati等[17]研究發(fā)現(xiàn)海洋細(xì)菌同溫層芽孢桿菌（Bacillus stratosphericus）FLU5在對(duì)石油污染土壤修復(fù)中具有重要作用，采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight-tandem mass spectrometry，MALDI-TOF-MS/MS）技術(shù)確定了菌株分泌的Surfactin的存在。石舉然等[9]從野生蜂蜜中篩選出1 株產(chǎn)廣譜抗菌活性物質(zhì)的芽孢桿菌LZ-5，利用柱層析及高效液相色譜等技術(shù)確定LZ-5產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)為IturinA2、IturinA3和IturinA6的混合物。

研究表明，不同種屬芽孢桿菌分泌的抗菌脂肽類別有顯著不同，其抗逆性及生物學(xué)功能也會(huì)有很大差異[18]。而且，即使是同一類菌株，發(fā)酵條件不同，也可能會(huì)產(chǎn)生不同結(jié)構(gòu)的環(huán)脂肽變異體，進(jìn)而發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。有關(guān)地衣芽孢桿菌所產(chǎn)抗菌物質(zhì)的研究也有報(bào)道，但抗菌特性與本研究有顯著差異。本研究從自然界中分離1 株廣譜抗性的菌株，進(jìn)一步通過物理化學(xué)復(fù)合誘變選育提高抗菌物質(zhì)產(chǎn)量，并從發(fā)酵液中分離純化抗菌物質(zhì)，通過質(zhì)譜分析其可能的與抑菌活性有關(guān)的脂肽類化合物組成及成分，以期為抗菌脂肽的研究和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品與菌種

本研究篩選土樣取自江蘇省徐州市云龍區(qū)徐州工程學(xué)院周邊菜地及泉山區(qū)云龍山。

供試菌株為本實(shí)驗(yàn)室從土樣中自行分離的菌株；用于檢測(cè)抑菌活性的參考菌株部分購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，部分由徐州工程學(xué)院江蘇省重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室保存，菌種如下：大腸桿菌（Escherichia coliCGMCC 1.1850）、傷寒沙門氏菌（Salmonella typhi）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureusCGMCC 1.128）、志賀氏菌（Shigella Castellani，本實(shí)驗(yàn)室保存）和銅綠假單胞和芽孢桿菌（Pseudomonas aeruginosaCGMCC 1.1785）、蠟樣芽孢桿菌（B. cereus，本實(shí)驗(yàn)室保存）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis，本實(shí)驗(yàn)室保存）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiaeCGMCC 2.3973）、尖孢鐮刀菌（Fusarium cusarium，本實(shí)驗(yàn)室保存）、深綠木霉（Trichoderma cerevisiae，本實(shí)驗(yàn)室保存）、黑曲霉（Aspergillus nigerCGMCC 3.6469）。

1.1.2 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）培養(yǎng)基：蛋白胨1 g/100 mL，牛肉膏0.5 g/100 mL，氯化鈉0.5 g/100 mL，瓊脂粉1.5 g/100 mL，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌15 min，用于指示菌培養(yǎng)。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖4.0 g/1 0 0 m L，牛肉膏0.5%，酵母提取物0.5 g/1 0 0 m L，蛋白胨1.5 g/100 mL，NaH2PO4·2H2O0.02 g/100 mL，Na2HPO4· 2H2O0.05g / 100 mL ，Mg2SO4·7H2O 0.05 g/100 mL，CaCl20.02 g/100 mL，MnSO40.02 g/100 mL，pH 7.4，121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

Sigma3k15型冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；GeneAmp 9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；JS-680D型凝膠成像系統(tǒng) 上海培清科技有限公司；1100型高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司；QexactiveOrbitrap型高分辨質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo Fisher公司；CascadaTMAN型超純水系統(tǒng) 美國(guó)PALL公司；UV-2450紫外-可見光分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株篩選

將土樣懸濁液80 ℃水浴處理20 min，系列稀釋并于NB平板涂布，37 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，將單菌落轉(zhuǎn)接于另一塊平板。培養(yǎng)2～3 d后的培養(yǎng)皿，在皿蓋中倒入1 mL氯仿，倒扣于超凈工作臺(tái)熏蒸50 min，倒掉多余氯仿并加稀釋5 倍的指示菌菌液1 mL，平板全部浸潤(rùn)后倒掉多余菌液，晾干平皿，室溫培養(yǎng)12 h后，觀察并記錄抑菌效果。

初篩得到菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)3 d。發(fā)酵液經(jīng)4 ℃、12 000 r/min離心5 min得發(fā)酵上清液。分別用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉為指示菌進(jìn)行抑菌活性復(fù)篩，選擇抑菌譜最廣、抑菌圈最大的菌株進(jìn)一步研究。

1.3.2 拮抗菌株分類鑒定

參照文獻(xiàn)[19]對(duì)拮抗菌株進(jìn)行形態(tài)特征觀察和生理生化實(shí)驗(yàn)。

拮抗菌株16S rDNA序列測(cè)定與分析：提取總DNA進(jìn)行16S rDNA序列PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì)如下：上游引物5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30 次循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。引物的合成和PCR產(chǎn)物的測(cè)序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。測(cè)序結(jié)果運(yùn)用BLAST軟件進(jìn)行序列比對(duì)，選取各不同屬的一些代表菌株的16S rDNA序列，用ClustalX1.83與MEGA5.1軟件，采用NJ（Neighbor-Joining）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 脂肽粗提物抗菌譜的測(cè)定

固體培養(yǎng)基打孔瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定發(fā)酵濾液抑菌活性。固體培養(yǎng)基滅菌后倒平板，待其凝固后，加入200 μL活化培養(yǎng)好的指示菌菌液，涂布均勻并晾干后，用無菌打孔器打孔，孔中加入100～200 μL發(fā)酵上清液，正面放置，培養(yǎng)1～3 d，觀察抑菌效果，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，以無菌水作陰性對(duì)照。其中細(xì)菌選用NB固體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，真菌選用馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基， 28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，然后觀察抑菌圈的有無，并采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，各處理重復(fù) 3 次。

1.3.4 菌株誘變

紫外線-硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）復(fù)合誘變：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液10 000 r/min離心5 min后，沉淀用生理鹽水稀釋成濃度為108個(gè)/mL的菌懸液。將裝有5 mL菌懸液的無菌平皿置于磁力攪拌器上，在實(shí)驗(yàn)前打開紫外燈預(yù)熱10 min，在距離15 W紫外燈30 cm處進(jìn)行誘變。分別照射6、9、15、30、45 s，每個(gè)照射時(shí)間各取0.1 mL處理后的菌液涂布于篩選平板上，30 ℃避光培養(yǎng)5 d，將致死率在95%以上平板上的菌株檢測(cè)抗菌活性。將活性高的菌株選為出發(fā)菌株，進(jìn)一步采用DES化學(xué)法誘變。菌懸液加入到體積為25 mL的三角瓶中，再加入0.2 mL體積分?jǐn)?shù)50%的DES溶液，振蕩不同時(shí)間，再加入0.5 mL 85%的硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)。取不同梯度的菌懸液稀釋涂布平板。37 ℃培養(yǎng)2～3 d。以金黃色葡萄球菌為指示菌，檢測(cè)菌株抑菌活性，選取抑菌活性最強(qiáng)的菌株。

遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：為分析突變菌的遺傳穩(wěn)定性，在固體板上活化菌，轉(zhuǎn)移到液體進(jìn)行一級(jí)培養(yǎng)。連續(xù)轉(zhuǎn)移10 次，分別發(fā)酵培養(yǎng)48 h，然后分析比較突變株抑菌能力的遺傳穩(wěn)定性。

1.3.5 脂肽分離與分析

1.3.5.1 脂肽Sephadex G-10凝膠層析分離

采用酸沉淀法進(jìn)行提取。誘變獲得的優(yōu)良菌株發(fā)酵液4 ℃、10 000 r/min離心10 min后，去除菌體，收集發(fā)酵上清液，用6 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH 2.0，輕微攪動(dòng)，4 ℃靜置24 h后于10 000 r/min離心15 min，收集沉淀，加入甲醇后用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 7.0，用甲醇抽提沉淀3 次，合并抽提液，于40～45 ℃減壓蒸發(fā)，得到固體粗提物。

用Sephadex G-10色譜柱對(duì)脂肽粗提物純化。10 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）平衡層析柱，固體抗菌物質(zhì)粗提物緩沖溶液溶解后上Sephadex G-10柱（1.6 cm×100 cm），用相同緩沖液洗脫，流速為0.4 mL/min，自動(dòng)收集器每管收集0.8 mL。將每管測(cè)定其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性。

1.3.5.2 脂肽粗提物反相高效液相色譜純化與鑒定

將經(jīng)過Sephadex G-10收集到的有抑菌活性的洗脫液用半制備高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)一步純化并檢測(cè)活性物質(zhì)的純度，以確保樣品的純度達(dá)到結(jié)構(gòu)鑒定的要求。樣品上柱前經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，洗脫劑經(jīng)抽濾裝置脫氣。高效液相色譜條件：色譜柱Agilent XDB-C18柱；紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm；以體積分?jǐn)?shù)5%～30%的乙腈線性梯度洗脫；柱溫25 ℃；流速0.5 mL/min。檢測(cè)收集管抗菌活性。

利用MALDI-TOF-MS對(duì)抑菌活性組分進(jìn)行分析鑒定，α-氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)溶解在含0.1%三氟乙酸的30%乙腈溶液中，采用正離子反射模式獲得譜圖。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 廣譜拮抗菌株的篩選

表1 篩選菌株發(fā)酵上清液抑菌譜Table 1 Antimicrobial spectrum of the fermentation supernatant of the screened strains

從土壤中共篩選出67 株具抑菌圈的菌株，其中抑菌活性強(qiáng)的菌株有8 株，結(jié)果如表1所示。7 種供試菌對(duì)沙門氏菌和金黃色葡萄球菌具有抑菌效果；6 種供試菌對(duì)枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌及大腸桿菌具有抑制作用；對(duì)銅綠假單胞菌及志賀氏菌可抑制的供試菌較少，僅3 種供試菌可對(duì)銅綠假單胞菌抑制；對(duì)釀酒酵母有抑制作用的有4 株，對(duì)霉菌黑曲霉和深綠木霉有抑制作用的菌株有7 株?？梢钥闯鼍闤F32與其他菌株的相比有顯著抑菌差異，對(duì)所選用的10 種指示菌都具有良好的抑制效果，菌株XF32發(fā)酵上清液對(duì)部分霉菌、酵母菌及細(xì)菌的抑菌情況如圖1所示。選擇菌株XF32進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

圖1 菌株XF32抗菌物質(zhì)對(duì)真菌和細(xì)菌的抑菌活性Fig. 1 Antifungal and antibacterial activities of antibacterial substances produced by strain XF32

2.2 拮抗菌株鑒定

2.2.1 菌落形態(tài)及生理生化鑒定

圖2 地衣芽孢桿菌形態(tài)Fig. 2 Morphological characteristics of strain XF32

菌株XF32在NB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，菌落形態(tài)如圖2所示。菌落為圓形，乳白色，邊緣不整齊，且表面粗糙不透明、有皺褶，中間有突起，具有芽孢桿菌典型的生長(zhǎng)特征。染色后顯微鏡下觀察，產(chǎn)芽孢，革蘭氏染色陽性，呈直桿狀，單個(gè)菌體，兩端鈍圓，芽孢橢圓中生。

表2 菌株XF32的生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain XF32

生理生化特征見表2。菌株XF32接觸酶陽性，VP陽性，厭氧生長(zhǎng)，能使明膠液化。不能夠利用吲哚和阿拉伯糖醇。能夠利用蔗糖、葡萄糖和木糖產(chǎn)酸，利用葡萄糖產(chǎn)氣。能夠在pH 5.5和pH 9.0的條件下生長(zhǎng)，耐受7%的鹽環(huán)境。

從菌株的形態(tài)以及生理生化特性看，本實(shí)驗(yàn)中分離篩選的菌株XF32與文獻(xiàn)[19]中標(biāo)準(zhǔn)菌株的相關(guān)指標(biāo)比較分析，可初步認(rèn)為菌株XF32屬于芽孢桿菌屬的地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）。

2.2.2 菌株的分子鑒定

圖3 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of strain XF32

為了進(jìn)一步確定XF32的種屬，經(jīng)16S rDNA分子生物學(xué)鑒定測(cè)序，菌株XF32 16S rDNA序列長(zhǎng)1 452 bp，與GenBank中所有已測(cè)定的原核生物的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，與之相似度達(dá)99%的菌株為地衣芽孢桿菌。選擇11 株相似性較高的標(biāo)準(zhǔn)菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖3可見，XF32與地衣芽孢桿菌自然聚為一支。因此，結(jié)合形態(tài)及生理生化特征，XF32鑒定為地衣芽孢桿菌。

2.3 拮抗菌株誘變結(jié)果

表3 誘變后復(fù)篩結(jié)果Table 3 Re-screening results after mutagenesis

測(cè)定復(fù)合誘變后不同篩選菌株的抑菌情況，由表3可知，抑菌圈直徑在10～15 mm和15～20 mm區(qū)間內(nèi)占大多數(shù)，比例分別為30.15%和33.09%。突變菌株XF32-22抑菌圈直徑27.8 mm，比誘變前的菌株抑菌圈直徑提高了52.7%。說明菌株的誘變獲得了較好效果。進(jìn)一步對(duì)突變株XF32-22生長(zhǎng)及抑菌活性的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行考察，如圖4所示。XF32-22連續(xù)傳代10 次，其抑菌圈直徑大小穩(wěn)定在19～22 mm，這與復(fù)篩的抑菌圈直徑大小一致。表明，XF32-22突變株具有較好的遺傳穩(wěn)定性。結(jié)合上述結(jié)果，紫外線-DES化學(xué)誘變的復(fù)合誘變方法在高產(chǎn)菌株的誘變選育中值得廣泛應(yīng)用。

圖4 遺傳穩(wěn)定性結(jié)果Fig. 4 Genetic stability of mutants

2.4 脂肽分離純化

2.4.1 脂肽Sephadex G-10凝膠層析

圖5 Sephadex G-10分離抗菌物質(zhì)Fig. 5 Elution profile of antifungal substances on Sephadex G-10

地衣芽孢桿菌XF32-22發(fā)酵液抗菌粗提物經(jīng)Sephadex G-10洗脫，215 nm波長(zhǎng)處紫外吸收檢測(cè)，出現(xiàn)4 個(gè)大的洗脫峰，分別表示為峰1～4。如圖5所示，對(duì)每支收集管檢測(cè)抗菌活性，結(jié)果顯示有抗菌活性的收集管主要集中在23～30號(hào)管，同吸收峰2相重疊。而其他吸收峰沒有檢測(cè)出抑菌性。將有活性收集管合并，進(jìn)一步分離純化。

2.4.2 脂肽半制備高效液相色譜分析

圖6 地衣芽孢桿菌XF32-22抗菌物質(zhì)的半制備高效液相色譜分離Fig. 6 Semi-preparative RP-HPLC profile of antimicrobial substance produced by XF32-22

經(jīng)Sephadex G-10純化后的抑菌活性物質(zhì)再經(jīng)過半制備高效液相色譜純化，結(jié)果如圖6所示。經(jīng)半制備高效液相色譜分離后，得到多個(gè)組分峰，由此說明前期純化的抗菌物質(zhì)中含有較多的雜質(zhì)成分。通過對(duì)各洗脫峰的抑菌活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，只有在出峰時(shí)間26 min的組分具有明顯的抑菌活性，說明經(jīng)過一系列的分離純化步驟，本研究已經(jīng)成功的獲得純度較高的抑菌活性物質(zhì)，將該組分收集后用于MALDI-TOF-MS鑒定。

2.4.3 抗菌物質(zhì)鑒定

芽孢桿菌的拮抗活性物質(zhì)主要為非核糖體途徑合成的脂肽類化合物。MALDI-TOF-MS分析廣泛應(yīng)用于芽孢桿菌脂肽類化合物的檢測(cè)。采用MALDI-TOF-MS對(duì)有抑菌活性的收集峰組分進(jìn)行分析，一級(jí)質(zhì)譜顯示，菌株XF32-22在m/z1 477.36、1 491.52和1 505.67處有離子峰（簇）出現(xiàn)（圖7），這3 個(gè)離子峰均對(duì)應(yīng)于Fengycin的質(zhì)量。3 個(gè)離子峰的相對(duì)分子質(zhì)量依次相差14，即恰好1 個(gè)CH2，推測(cè)其屬脂肪酸鏈上差1 個(gè)亞甲基所導(dǎo)致，該物質(zhì)與已報(bào)道的脂肽類化合物Fengycin的相對(duì)分子質(zhì)量一致。目前，關(guān)于Fengycin化合物的鑒定主要是依據(jù)其質(zhì)譜分子峰。綜上所述，質(zhì)譜分析證明抗菌物質(zhì)主峰中主要成分為脂肽類化合物Fengycin，且含量較純，根據(jù)峰面積可計(jì)算出純度達(dá)90%以上。同時(shí)也證明了該脂肽粗提物分離后的活性較高產(chǎn)物主要成分為Fengycin。由此推斷分離篩選的具有廣譜抗菌活性的XF32菌株拮抗活性可能與其脂肽化合物的合成與分泌有關(guān)。

圖7 地衣芽孢桿菌XF32-22脂肽類化合物的MALDI-TOF-MS分析Fig. 7 MALDI-TOF-MS of lipopeptides produced by strain XF32-22

3 討 論

芽孢桿菌是一類產(chǎn)生抗菌脂肽的重要微生物資源，目前對(duì)于芽孢桿菌抗菌脂肽的報(bào)道較多，有枯草芽孢桿菌（B. subtilis）[18]、莫海威芽孢桿菌（B. mojavensis）[18]、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（B. methylotrophicus）[20]、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）[7,21-22]等，這些研究主要集中在抗菌脂肽在分離純化、抑菌活性及植物保護(hù)方面的應(yīng)用，因產(chǎn)量較低、抑菌譜窄，抗菌脂肽的應(yīng)用范圍受到極大限制。本研究篩選到1 株廣譜抗菌菌株，通過菌落形態(tài)、生理生化測(cè)定及16S rDNA進(jìn)一步分析，菌株鑒定地衣芽孢桿菌，進(jìn)一步豐富了產(chǎn)抗菌脂肽的微生物資源。目前已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道地衣芽孢桿菌分泌脂肽，Batrakov等[23]從深井熱水中分離的地衣芽孢桿菌603所產(chǎn)脂肽對(duì)棒狀桿菌屬（Corynebacterium variabilis）菌株有抑菌活性，對(duì)不動(dòng)桿菌（Acinetobactersp.）抑菌活性很弱。Rivardo等[24]研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用地衣芽孢桿菌V9T14所產(chǎn)脂肽對(duì)大腸桿菌的抑制作用效果遠(yuǎn)低于其和多種抗生素協(xié)同作用。Lawrance等[25]從島上分離了產(chǎn)生抗菌脂肽的地衣芽孢桿菌NIOT-AMKV06，其脂肽具有強(qiáng)熱穩(wěn)定性和顯著降低表面活性的特征，對(duì)致病菌糞腸球菌、傷寒沙門氏菌以及枯草芽孢桿菌有顯著抑菌活性，但對(duì)大腸桿菌無抑菌活性，抑菌譜較窄。與已報(bào)道文獻(xiàn)對(duì)比，本研究分離的地衣芽孢桿菌XF32菌株所產(chǎn)抗菌物質(zhì)抑菌譜廣，對(duì)本實(shí)驗(yàn)的革蘭氏陽性菌、陰性菌及真菌均具有顯著的抑菌活性，這為其后續(xù)開發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

為進(jìn)一步提高菌株脂肽產(chǎn)量，本研究采用紫外線和DES 2 種誘變技術(shù)，通過抑菌圈法篩選到了脂肽產(chǎn)量顯著提高的菌株XF32-22，其抗菌脂肽產(chǎn)量與野生菌XF32相比顯著提高。且遺傳穩(wěn)定性良好，為其工業(yè)化發(fā)酵和實(shí)際應(yīng)用提供了可行性，為利用多種誘變技術(shù)遺傳選育高產(chǎn)抗菌肽菌株提供了新的研究方法和思路。

芽孢桿菌屬菌株最大優(yōu)點(diǎn)是繁殖速度快、營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單，具有抗逆性芽孢，能產(chǎn)生數(shù)十種次生代謝產(chǎn)物，脂肽是非常重要的一類，包括Surfactin、Fengycin、Iturin三個(gè)最重要的家族[7]，脂肽一般是由羥基脂肪酸和氨基酸連接成的環(huán)肽，Iturin主要抑制真菌生長(zhǎng)[5]，Surfactin主要抑制細(xì)菌、病毒、支原體生長(zhǎng)[26]，F(xiàn)engycin對(duì)絲狀真菌有強(qiáng)烈的抑制作用[27]。目前已有許多芽孢桿菌菌株用于控制植物病害[14,16]，特別是用于真菌病，例如灰霉病菌（Botrytis cinerea）、辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）[28-31]。本研究篩選的地衣芽孢桿菌菌株發(fā)酵液中獲得脂肽粗提物，抑菌結(jié)果顯示對(duì)革蘭氏陽性菌、陰性細(xì)菌和真菌均有顯著抑制作用，由此推測(cè)菌株XF32-22在發(fā)酵中除主要產(chǎn)生Fengycin類脂肽外，還可能同時(shí)產(chǎn)生多種類型的抗菌物質(zhì)，如Surfactin、Iturin等，這些抗菌脂肽在抑菌過程中可能協(xié)同發(fā)揮作用[31]，增強(qiáng)整體抑菌效果。Ongena等[32]報(bào)道枯草芽孢桿菌S499產(chǎn)生的Surfactin和Fengycin類脂肽兩者協(xié)同作用增強(qiáng)了抑菌能力。張榮勝等[22]發(fā)現(xiàn)從解淀粉芽孢桿菌Lx-11發(fā)酵液中提取的粗提物中含有Surfactin、Bacillomycin D和Fengycin 3 種脂肽類抗生素，協(xié)同發(fā)揮較強(qiáng)的生防特性。

本研究對(duì)產(chǎn)脂肽的地衣芽孢桿菌XF32-22的發(fā)酵液進(jìn)行酸沉淀處理，再過Sephadex G-10柱層析，上步的活性組分經(jīng)過半制備高效液相色譜分離，將抗菌活性組分進(jìn)行MALDI-TOF-MS鑒定，確定為Fengycin。Fengycin是芽孢桿菌產(chǎn)生的抑菌脂肽中的一大類[4]，對(duì)多種植物病原真菌，尤其是絲狀真菌有較強(qiáng)的拮抗作用，低濃度時(shí)可導(dǎo)致病原菌細(xì)胞膜通透性改變，進(jìn)而起到抑菌作用，高濃度時(shí)則以表面活性劑的方式作用于生物膜，破壞病菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[33]。因脂肽具有穩(wěn)定性好、不易產(chǎn)生抗藥性、高效抗真菌等優(yōu)點(diǎn)，因而成為生物防治、食品防腐、醫(yī)藥等領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。如Hentati等[17]研究了1 株枯草芽孢桿菌FLU5所產(chǎn)生的有Surfactant脂肽類化合物，在環(huán)境修復(fù)中具有重要意義；Aktuganov等[15]報(bào)道了菌株P(guān)aenibacillus ehimensisIB-X-b可以產(chǎn)生多種Fengycin/Plipastatin A-C16類型的環(huán)狀脂肽。

國(guó)內(nèi)外對(duì)芽孢桿菌抗菌脂肽的研究越來越深入，已從菌株分離、抗菌肽純化、鑒定深入到遺傳、代謝和機(jī)理改造等方面。本研究分離篩選并誘變選育了地衣芽孢桿菌菌株XF32-22，分析了菌株分泌的脂肽類化合物的種類及抑菌特性，并為進(jìn)一步采用基因工程的手段改良芽孢桿菌菌株，大幅度提高脂肽的發(fā)酵產(chǎn)量，為以后開發(fā)推廣抗菌脂肽的應(yīng)用范圍打下了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究針對(duì)目前抗菌脂肽生產(chǎn)菌株在生產(chǎn)能力利用上的不足，從自然界中分離到1 株廣譜抗菌效果的菌株，生理生化指標(biāo)結(jié)合16S rDNA序列測(cè)序結(jié)果表明XF32是地衣芽孢桿菌。進(jìn)一步采用紫外-DES法誘變育種技術(shù)選育出了1 株脂肽生產(chǎn)性能優(yōu)良的高產(chǎn)菌株XF32-22。和傳統(tǒng)單純使用紫外誘變以及利用菌株自發(fā)突變獲取抗性突變株相比，采用紫外誘變結(jié)合DES復(fù)合誘變可以提高菌株的突變率，加快菌株選育的進(jìn)程，更有效地提高脂肽產(chǎn)量，適合產(chǎn)抗菌脂肽菌株地衣芽孢桿菌XF32的誘變。利用酸沉淀、Sephadex G-10凝膠層析和半制備高效液相色譜獲得了高純度的抑菌活性物質(zhì)，經(jīng)MALDI-TOF-MS分析，確定抗菌物質(zhì)為脂肽類Fengycin。該脂肽對(duì)本研究使用的指示菌革蘭氏陰性細(xì)菌、陽性細(xì)菌及酵母菌和絲狀真菌均具有顯著的抑菌活性，有潛力在植物生防、食品防腐及醫(yī)藥等行業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。研究為尋找新的具有廣譜抗菌活性的代謝產(chǎn)物奠定了理論基礎(chǔ)。