蔡雨晨，李孟澤，李利君,2，倪輝,2

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建廈門 361021）

（2.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門 361021）

關(guān)鍵字：α-L-鼠李糖苷酶；進(jìn)化樹；代表性序列；結(jié)構(gòu)特征

α-L-鼠李糖苷酶（α-L-rhamnosidase，EC3.2.1.40）是一種專一性水解鼠李糖苷鍵的酶[1]，近年來(lái)，在食品加工特別是飲料加工中被廣泛應(yīng)用，如水解柚子中的苦味物質(zhì)制作柚子汁，改善釀造酒及果汁的風(fēng)味等[2]，此外，α-L-鼠李糖苷酶還可作為食品添加劑改變流體性質(zhì)[3]。在自然界中，α-L-鼠李糖苷酶主要來(lái)源于細(xì)菌[4]和霉菌[5]，最初是從青霉菌和曲霉菌代謝生產(chǎn)的酶制劑中純化得到，國(guó)外關(guān)于真菌中α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆研究也主要集中于曲霉來(lái)源的α-L-鼠李糖苷酶[6]；在碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)（CAZy）[7]中，α-L-鼠李糖苷酶主要存在于糖苷水解酶第 78家族（glucoside hydrolase family 78，GH78），少量存在于GH28和GH106家族中，且來(lái)源于真菌的晶體結(jié)構(gòu)有且僅有一個(gè)，即Aspergillus terreus來(lái)源的α-L-鼠李糖苷酶（PDB:6gsz）[8]，因此對(duì)曲霉來(lái)源的α-L-鼠李糖苷酶在蛋白結(jié)構(gòu)方面上缺乏系統(tǒng)性研究。

序列比對(duì)是解決進(jìn)化樹構(gòu)建、保守區(qū)和保守位點(diǎn)分析等眾多問題的開端和基礎(chǔ)步驟[9]。系統(tǒng)進(jìn)化樹能夠展示蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，描述發(fā)生或進(jìn)化順序，是系統(tǒng)性分析蛋白或基因序列的重要手段[10]。同源建模是利用蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)比一級(jí)結(jié)構(gòu)更保守的原理，使用已經(jīng)確定結(jié)構(gòu)的模板蛋白對(duì)未知結(jié)構(gòu)的蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)建[11]。穿線法建模則利用自然界中蛋白質(zhì)折疊類型數(shù)目是一定的，且相似性比較低的氨基酸序列可能對(duì)應(yīng)著一致的折疊類型這一原理，彌補(bǔ)同源建模中必須有相似度較高的模板的這一不足[12,13]。

通過(guò)三級(jí)結(jié)構(gòu)建模對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行直觀的觀察[14]，并結(jié)合結(jié)構(gòu)疊合的方法進(jìn)一步對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分類，可以分析得到結(jié)構(gòu)進(jìn)化的規(guī)律。因此，本文通過(guò)序列比對(duì)方法及進(jìn)化樹構(gòu)建技術(shù)對(duì)曲霉來(lái)源的α-L-鼠李糖苷酶進(jìn)行研究，并利用生物信息學(xué)手段對(duì)α-L-鼠李糖苷酶蛋白序列的一級(jí)序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，再采用同源建模與穿線法建模的方法進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)建模，結(jié)合結(jié)構(gòu)疊合的結(jié)果，綜合分析探索曲霉來(lái)源α-L-鼠李糖苷酶的蛋白結(jié)構(gòu)特征。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)源

進(jìn)入美國(guó)國(guó)家生物信息中心 NCBI網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），輸入檢索詞“（α-L-rhamnosidase）AND "Aspergillus"”，下載NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)中曲霉來(lái)源α-L-鼠李糖苷酶核酸序列的FASTA文件和GenBank文檔，并使用NCBI Blast+2.10.0[15]篩選出非重復(fù)序列。

1.2 分析方法

1.2.1 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

利用 ClustalX 2.0[16]軟件進(jìn)行核酸和蛋白質(zhì)的多序列比對(duì)；運(yùn)用 MEGAX 6.0[17]軟件對(duì)得到的多序列比對(duì)結(jié)果分別構(gòu)建核酸和蛋白質(zhì)序列進(jìn)化樹。

1.2.2 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

（1）通過(guò) ProtParam[18]（https://web.expasy.org/protparam/）工具預(yù)測(cè)蛋白的理化性質(zhì)；

（2）利用 ProtScale[19]（http://www.expasy.org/cgi-bin /protscale.pl）工具進(jìn)行蛋白質(zhì)疏水性分析；

（3）利用 TMHMM 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0）工具尋找蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域并進(jìn)行分析；

（4）使用 SignalP 5.0[20]（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）工具進(jìn)行蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析。

1.2.3 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用同源建模在線服務(wù)器 Swiss-Model[11]（https://swissmodel.expasy.org/），穿針引線法建模在線服務(wù)器 I-TASSER[12]（https://zhanglab.ccmb.med.umich. edu/ I-TASSER/）和 Phyre2[13]（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）進(jìn)行蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)建模，并使用工具 Verify3D[21]（https://servicesn. mbi.ucla.edu/Verify3D/）對(duì)模型的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)分析；運(yùn)用UCSF Chimera 1.14[22]軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)結(jié)合疊合和比對(duì)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)都根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法中各個(gè)軟件及網(wǎng)站收集得來(lái)，最多保留兩位小數(shù)；序列比對(duì)結(jié)果使用Espript 3.0[23]（http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ ESPript.cgi）進(jìn)行美化；281條核酸序列進(jìn)化樹使用 ITOL（https://itol.embl.de/）進(jìn)行美化；21條蛋白序列進(jìn)化樹使用MEGAX 6.0軟件自動(dòng)生成的圖片結(jié)果；蛋白三維結(jié)構(gòu)模型及結(jié)構(gòu)疊合結(jié)果使用 UCSF Chimera 1.14軟件對(duì)進(jìn)行渲染。

2 結(jié)果與討論

2.1 曲霉來(lái)源α-L-鼠李糖苷酶的核酸序列分析

2.1.1 核酸序列數(shù)據(jù)收集

表1 NCBI中291條曲霉來(lái)源α-L-鼠李糖苷酶核酸序列統(tǒng)計(jì)信息Table 1 Sequence statistics of α-L-rhamnosidase from 310 Aspergillus species in NCBI

表2 21條代表性核酸序列對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)登錄號(hào)Table 2 The corresponding protein registration numbers of 21 representative nucleic acid sequences

在NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)中，檢索到291條曲霉來(lái)源的α-L-鼠李糖苷酶核酸序列，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)將它們分成了37個(gè)種類（表1）。發(fā)現(xiàn)幾乎所有種類的曲霉都有分離純化得到α-L-鼠李糖苷酶的記錄。

2.1.2 核酸系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建及代表性序列篩選

篩除掉10條完全重復(fù)序列，最終得到281條未重復(fù)曲霉來(lái)源的α-L-鼠李糖苷酶核酸序列，然后對(duì)281條核酸序列建立進(jìn)化樹（圖1），并根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹篩選出21條代表性的核酸序列（圖1中的橙色標(biāo)識(shí)），并得到了對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)序列（表2）。

圖1 281條曲霉來(lái)源α-L-鼠李糖苷酶核酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of 281 Aspergillus derived α-L-rhamnosidase nucleic acid sequences

2.2 曲霉來(lái)源α-L-鼠李糖苷酶的蛋白序列分析

2.2.1 多序列比對(duì)分析

多序列比對(duì)結(jié)果顯示了α-L-鼠李糖苷酶蛋白質(zhì)序列的保守氨基酸位點(diǎn)（圖2），發(fā)現(xiàn)這21條α-L-鼠李糖苷酶代表序列的氨基酸保守位點(diǎn)較為分散且僅有22個(gè)較保守位點(diǎn)，分別位于285、359、392、507、510、574、595、596、626、631、634、648、644、651、678、681、684、685、825、831、844和852位，推測(cè)這些氨基酸是與保持結(jié)構(gòu)或催化功能密切相關(guān)的極其重要關(guān)鍵性氨基酸，且并沒有發(fā)現(xiàn)有非常保守的位點(diǎn)和保守區(qū)存在，說(shuō)明選擇的這21條序列相互獨(dú)立，可以通過(guò)對(duì)這 21條代表性序列的分析可以基本概括出所有曲霉來(lái)源α-L-鼠李糖苷酶的相關(guān)規(guī)律。

2.2.2 理化性質(zhì)分析

對(duì)21條代表性蛋白質(zhì)序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析（表3）發(fā)現(xiàn)它們氨基酸數(shù)量范圍為556～1032個(gè)，分子量（Mr）的極差為37606 u，原子總數(shù)的極差為5225個(gè)，在氨基酸數(shù)量、分子量、原子總數(shù)上波動(dòng)較大。對(duì)負(fù)電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）和正電荷殘基總數(shù)（Arg+lys）進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)負(fù)電荷殘基總數(shù)略多，大多帶負(fù)電荷。理論等電點(diǎn)（pI）的范圍是 4.66～7.17，除了XP_660235.1的pI為7.13、XP_664533.1為7.17，是弱堿性蛋白質(zhì)；其余α-L-鼠李糖苷酶蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)都小于7，屬于酸性蛋白質(zhì)，與張霞[6]總結(jié)的關(guān)于真菌來(lái)源的α-L-鼠李糖苷酶的pI實(shí)驗(yàn)值一致；α螺旋指數(shù)的范圍是71.36～86.19；親水性平均系數(shù)的范圍是-0.355到-0.051，說(shuō)明曲霉來(lái)源的α-L-鼠李糖苷酶為親水性蛋白[24]。

圖2 曲霉來(lái)源21條α-L-鼠李糖苷酶序列保守位點(diǎn)Fig.2 Conserved sites of 21 α-L-rhamnosidase sequences from Aspergillus species

表3 21條曲霉來(lái)源α-L-鼠李糖苷酶理化性質(zhì)預(yù)測(cè)Table 3 Prediction of physicochemical properties of α-L-rhamnosidase from 21 Aspergillus species

2.2.3 疏水性和跨膜區(qū)分析

氨基酸的疏水性反映α-L-鼠李糖苷酶的折疊情況，在潛在的跨膜區(qū)域會(huì)出現(xiàn)疏水區(qū)。對(duì)親水性平均系數(shù)比較小的XP_660235.1蛋白進(jìn)行疏水性分析和跨膜區(qū)預(yù)測(cè)。使用ProtScale得到了對(duì)XP_660235.1蛋白的分析結(jié)果（圖3）。發(fā)現(xiàn)XP_660235.1在100～200之間有明顯的兩個(gè)疏水峰，是潛在的跨膜區(qū)域[25]。

圖3 XP_660235.1蛋白的疏水性預(yù)測(cè)圖Fig.3 Hydrophobicity prediction map of XP_660235.1 protein

使用TMHMM工具預(yù)測(cè)XP_660235.1蛋白的跨膜區(qū)，發(fā)現(xiàn)136到158位和171到193位擁有跨膜螺旋區(qū)的可能性接近1（圖4），說(shuō)明XP_660235.1蛋白有兩部分位于細(xì)胞膜表面，分別是氨基酸序列的 1到135位和194到568位，XP_660235.1為兩次跨膜的蛋白質(zhì)，這與 ProtScale預(yù)測(cè)結(jié)果一致。對(duì)剩余的20條蛋白質(zhì)序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示無(wú)跨膜區(qū)存在。

圖4 XP_660235.1蛋白的跨膜區(qū)預(yù)測(cè)圖Fig.4 Prediction map of transmembrane region of XP_660235.1 protein

2.2.4 蛋白進(jìn)化樹分析

對(duì)這21條曲霉來(lái)源α-L-鼠李糖苷酶蛋白質(zhì)序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建分析（圖 5），根據(jù)進(jìn)化樹結(jié)果可以將21條代表性序列分為兩組，第一組包含17個(gè)序列為 XP_660235.1、XP_664533.1、XP_748610.1、XP_749916.1、XP_001395635.2、XP_001398938.2、XP_002383141.1、XP_002385047.1、XP_022403539.1、XP_001727134.1、CCB96437.1、XP_681734.1、XP_659810.1、XP_026602402.1、XP_026602632.1、XP_026603987.1、XP_026628025.1，第二組包含 4個(gè)序列為 XP_022383582.1、XP_025515427.1、XP_026602627.1、XP_026603527.1。

圖5 21條曲霉來(lái)源α-L-鼠李糖苷酶蛋白質(zhì)序列構(gòu)建的鄰接法進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of 21 Aspergillus derived α-L-rhamnosidase protein sequences

2.2.5 信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析

表4 信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果Table 4 Prediction results of signal peptide

在 SignalP 5.0的預(yù)測(cè)結(jié)果中（表 4），XP_002383141.1、XP_022403539.1、XP_659810.1、XP_001395635.2、XP_022383582.1、XP_748610.1、XP_001398938.2、XP_025515427.1、XP_026602627.1和XP_026603527.1共10條α-L-鼠李糖苷酶蛋白序列含有信號(hào)肽。與進(jìn)化樹分類結(jié)果結(jié)合發(fā)現(xiàn)，含有信號(hào)肽的序列均勻的分布在第一組與第二大組中，說(shuō)明曲霉來(lái)源的α-L-鼠李糖苷酶存在胞外酶與胞內(nèi)酶兩種，且信號(hào)肽的有無(wú)不能反映出曲霉來(lái)源α-L-鼠李糖苷酶的進(jìn)化規(guī)律。

2.3 曲霉來(lái)源 α-L-鼠李糖苷酶的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 三級(jí)結(jié)構(gòu)建模分析

表5 Verify3D建模評(píng)分表Table 5 Verify3D modeling scoring table

對(duì)21條曲霉來(lái)源α-L-鼠李糖苷酶的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行三維建模，其中 5條采用同源建模法，另外 16條采用穿針引線法進(jìn)行建模。對(duì)所有蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)建模結(jié)果進(jìn)行Verify3D評(píng)價(jià)。從結(jié)果（表5）中可以看到蛋白質(zhì)序列的得分比最小值為80.0%，說(shuō)明α-L-鼠李糖苷酶的蛋白質(zhì)序列的建模結(jié)果良好。

2.3.2 結(jié)構(gòu)疊合分析

結(jié)構(gòu)疊合的分類結(jié)果顯示（表6），這21個(gè)曲霉來(lái)源α-L-鼠李糖苷酶可分為兩大類（圖 6），XP_681743.1、XP_664533.1、XP_660235.1、XP_026602402.1、XP_022403539.1、XP_659810.1、XP_001727134.1、XP_026602632.1、XP_026603987.1、XP_026628025.1、XP_748610.1、XP_749916.1、XP_001395635.2、XP_001398938.2、XP_002383141.1、XP_002385047.1與CCB96437.1共17條序列組成第一大類，每條序列都擁有一個(gè)(α/α)6桶狀結(jié)構(gòu)和桶底的一個(gè)β折疊結(jié)構(gòu)這一基本結(jié)構(gòu)，根據(jù)除基本結(jié)構(gòu)外的β片層結(jié)構(gòu)的數(shù)量，又可以將第一大類分為4個(gè)小類（圖7），其中XP_664533.1與XP_660235.1組成無(wú)額外β片層的第一個(gè)小類；XP_022383582.1、XP_749916.1、XP_001395635.2、XP_001398938.2 與XP_002383141.1共5條序列組成有1個(gè)額外β片層的第二小類；XP_659810.1、XP_001727134.1、XP_026603987.1、XP_026628025.1、XP_748610.1 與XP_002385047.1共6條序列組成有2個(gè)額外β折疊的第三小類；XP_681743.1、XP_026602402.1、XP_026602632.1與CCB96437.1共4條序列組成有3個(gè)額外β折疊的第四小類，目前已報(bào)道的曲霉來(lái)源的晶體結(jié)構(gòu)（PDB:6gsz）[8]就屬于這一類；XP_022383582.1、XP_026602627.1、XP_025515427.1與XP_026603527.1共4條序列組成第二大類，與第一大類不同，第二大類4個(gè)序列都屬于GH106家族，因此擁有GH106的基本結(jié)構(gòu)(α/β)8結(jié)構(gòu)和環(huán)繞在桶裝結(jié)構(gòu)域周圍的β折疊結(jié)構(gòu)[26]。第一大類與第二大類的分類結(jié)果與進(jìn)化樹分類相符，說(shuō)明蛋白的進(jìn)化規(guī)律會(huì)一定程度的體現(xiàn)在其三級(jí)結(jié)構(gòu)上；第一大類的四個(gè)小類與進(jìn)化樹分類不符，說(shuō)明β折疊結(jié)構(gòu)的數(shù)量并不能反映曲霉來(lái)源α-L-鼠李糖苷酶的進(jìn)化規(guī)律。

表6 結(jié)構(gòu)分類表Table 6 Structure classification table

圖6 α-L-鼠李糖苷酶的兩個(gè)大類疊合圖Fig.6 Two kinds of superposition graphs of α-L-rhamnosidase

圖7 α-L-鼠李糖苷酶的第一大類的四個(gè)小類疊合圖Fig.7 Four subclasses of the first class of α-L-rhamnosidase

3 結(jié)語(yǔ)

本文通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，收集了所有非重復(fù)的曲霉來(lái)源α-L-鼠李糖苷酶的核酸數(shù)據(jù)共291條，并通過(guò)進(jìn)化樹篩選得到具有代表性的 21條序列并預(yù)測(cè)了蛋白理化性質(zhì)。通過(guò)對(duì)這21條代表性序列進(jìn)行序列比對(duì)和進(jìn)化樹構(gòu)建發(fā)現(xiàn)，雖然這21條序列具有非常少的保守位點(diǎn)，但是它們之間依然存在進(jìn)化規(guī)律，且根據(jù)這一進(jìn)化規(guī)律，可以將這些序列分為兩組；信號(hào)肽分析結(jié)果顯示有 10條序列含有信號(hào)肽，說(shuō)明曲霉來(lái)源的α-L-鼠李糖苷酶有胞外酶與胞內(nèi)酶兩種；跨膜區(qū)分析發(fā)現(xiàn)1條來(lái)源于Aspergillus nidulans的α-L-鼠李糖苷酶為二次跨膜蛋白；通過(guò)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)建模及疊合，發(fā)現(xiàn)21條α-L-鼠李糖苷酶主要存在于GH78與GH106家族中，將21條α-L-鼠李糖苷酶分為兩個(gè)類型，第一大類都含有一個(gè)(α/α)6桶狀結(jié)構(gòu)和桶底的一個(gè)β片層結(jié)構(gòu)，并根據(jù)額外含有的β片層結(jié)構(gòu)的數(shù)量進(jìn)一步分成4個(gè)小類；第二大類則含有1個(gè)(α/β)8結(jié)構(gòu)和環(huán)繞在桶裝結(jié)構(gòu)域周圍的β片層結(jié)構(gòu)，且結(jié)構(gòu)疊合分類與進(jìn)化樹的分類一致，說(shuō)明蛋白的進(jìn)化規(guī)律會(huì)一定程度的體現(xiàn)在其三級(jí)結(jié)構(gòu)上，而小類的分類結(jié)果說(shuō)明β折疊結(jié)構(gòu)的數(shù)量并不能作為說(shuō)明曲霉來(lái)源α-L-鼠李糖苷酶進(jìn)化規(guī)律的依據(jù)。本文通過(guò)篩選出21條代表性序列闡明曲霉來(lái)源的α-L-鼠李糖苷酶蛋白序列性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征，系統(tǒng)性的分析了其結(jié)構(gòu)規(guī)律，為該酶的定向進(jìn)化和分子改造提供了強(qiáng)有力的參考。