李敏蘭，弓澤華，盛滟，凌俊紅

（浙江海洋大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山 316000）

巖藻黃素，亦稱巖藻黃質(zhì)、褐藻素[1]，是一類主要來源于褐藻的類胡蘿卜素[2]，其粉末為黃褐色。巖藻黃素的多個共軛雙鍵以及具有羥基、羰基和丙二烯等結(jié)構(gòu)特點使其具有活潑的化學(xué)性質(zhì)，如易氧化降解[3]，易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑。巖藻黃素廣泛分布于中國、日本及朝鮮等國家的海岸地區(qū)，來源豐富。大量研究表明巖藻黃素具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗瘧疾、抗痘、調(diào)血糖等多種生物活性[4-8]，有關(guān)巖藻黃素的研究和開發(fā)利用前景廣闊。本文系統(tǒng)地總結(jié)了巖藻黃素的提取、分離純化及含量測定等方法的現(xiàn)狀，旨在為巖藻黃素的開發(fā)利用提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 提取方法

1.1 溶劑浸提法

巖藻黃素為脂溶性色素，根據(jù)相似相溶原理，使用有機(jī)溶劑浸提是巖藻黃素常用的提取方法。大部分試驗表明提取巖藻黃素的最佳溶劑為甲醇[9-10]，而韓典峰等[11]、顧曉慧等[12]得出提取巖藻黃素的最佳溶劑為乙醇。Kim[13]從三角褐指藻中提取巖藻黃素，發(fā)現(xiàn)乙醇作為溶劑提取巖藻黃素能得到更好的提取效果，其次為丙酮和乙酸乙酯。閆相勇等[14]研究海帶中巖藻黃素浸提的最佳工藝參數(shù)，在60℃，料液比1∶40（g/mL）的條件下避光靜置，甲醇浸提2次，每次1 h，巖藻黃素的提取率為0.375mg/g。劉梁等[15]采用有機(jī)溶劑提取法從海帶中提取巖藻黃素，使用80%甲醇、料液比1∶10（g/mL）、40℃提取1 h、提取2次，巖藻黃素提取效果最好，提取率為0.556 mg/g。李紅艷等[16]以鼠尾藻為原料，采用有機(jī)溶劑法提取巖藻黃素，結(jié)果表明90%甲醇、料液比 1∶33（g/mL）、60℃提取 3.25 h時，巖藻黃素提取效果好，提取率為1.368 mg/g。Wang等[17]將1 g新鮮海帶用4 mL二甲亞砜處理60 min，得巖藻黃素的純度約為63%。

此外，通過使用混合溶劑提取也顯示出了較好的提取效果。尹宗美等[18]用正己烷和丙酮的混合溶劑提取羊棲菜藻渣中巖藻黃素，結(jié)果顯示最佳提取條件為料液比 1 ∶30（g/mL），丙酮 ∶正己烷體積比 1 ∶6，55 ℃水浴加熱提取2次，每次提取60 min，巖藻黃素提取率為0.68 mg/g。

1.2 酶提取法

李斌等[19]考察纖維素酶、果膠酶及兩者的混合酶提取海帶渣中的巖藻黃素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)果膠酶法為巖藻黃素提取的最佳方法，條件為果膠酶加酶量20 000 U/kg，酶解溫度60℃，酶解pH 5.0，酶解時間1.5 h，巖藻黃素得率為0.124%。李奕葶等[20]利用酶解法從海帶中提取巖藻黃素，得出最佳酶解條件為：纖維素酶和果膠酶添加量分別為7.5%和3%（酶容積/海帶干重），酶解pH 5.0，溫度50.0℃，酶解時間1.5 h后，用80%乙醇作為提取溶劑，在料液比1∶15（g/mL）、溫度55℃條件下提取24 h，巖藻黃素得率為（1.471±0.063）mg/g（以干重計）。秦云等[21]采用復(fù)合酶法提取海帶中的巖藻黃素，在pH5.0、溫度50℃、酶加入量0.30%（原料質(zhì)量計）的條件下酶解時間80 min，巖藻黃素得率為18.30 mg/100 g。此外，Billakanti等[22]通過使用海藻酸鈉裂解酶對新鮮裙帶菜進(jìn)行預(yù)處理，導(dǎo)致其細(xì)胞壁多糖的水解，得巖藻黃素提取率為94%。

酶提取法結(jié)合其它提取方法也顯示了較好的優(yōu)勢。畢可海等[23]以海帶為原料，采用超聲輔助生物酶對海帶進(jìn)行破壁處理，發(fā)現(xiàn)在酶解溫度為58℃，酶解時間為71 min，酶解pH值為5.0的條件下，巖藻黃素的提取量可達(dá)0.837 5 mg/g。這比單獨使用酶法或超聲輔助法所得的提取效率都高?？梢娤啾绕渌崛》椒ǎ阜ㄌ崛r藻黃素具有高提取率和低能耗等優(yōu)點。

1.3 超聲輔助提取法

超聲輔助提取法是應(yīng)用比較多的一種方法，具有省時、節(jié)能、提取率高等優(yōu)點[24]。趙鵬[25]探究了超聲輔助提取法對海帶中巖藻黃素提取效果的影響，考察了溫度、時間、料液比等因素對提取率的影響，并與傳統(tǒng)溶劑提取法進(jìn)行了比較，得出超聲輔助提取的最佳條件為：溫度50.13℃，時間60.99 min，超聲功率45 Hz，料液比 1∶50（g/mL），巖藻黃素的提取率為 0.35 mg/g，該方法提取率比傳統(tǒng)溶劑提取提高了50.6%。萇釗等[26]以裙帶菜為提取原料，得到超聲輔助提取巖藻黃素的最佳提取工藝為：40℃條件下超聲30 min，90%乙醇，料液比 1 ∶10（g/mL），巖藻黃素提取率為 1.362 mg/g。陳文佳等[27]從海帶中提取巖藻黃素，得出最佳超聲時間為30 min。此外，王樂等[28]以鼠尾藻為提取原料，除分別探究溫度、時間等因素對提取效果的影響外，還在提取過程中加入了L-抗壞血酸，采用響應(yīng)面法優(yōu)化出最佳提取工藝為：超聲溫度52℃，超聲時間32 min，料液比1∶10（g/mL），80%乙醇，L-抗壞血酸的添加量0.8%（原料質(zhì)量計），提取2次，巖藻黃素得率（0.048±0.002）mg/g，純度為（86.88±1.34）%。李紅艷等[29]以新鮮銅藻為研究對象，溫度45℃，90%乙醇，料液比1 ∶5（g/mL），超聲時間 18 min，提取 2 次，得到巖藻黃素的提取率為0.29 mg/g鮮重或1.46 mg/g干重。

1.4 超臨界流體萃取法

超臨界流體萃取法是一種在20世紀(jì)30年代興起的提取和分離技術(shù)，一般以液態(tài)CO2作為萃取溶劑[30]。液體在超臨界范圍內(nèi)兼具氣液兩性的性質(zhì)，此液體在萃取混合物時利用溶質(zhì)溶解能力隨壓力和溫度改變的特點，通過改變提取溫度、提取壓力、CO2消耗量等萃取條件，達(dá)到提取分離目標(biāo)化合物的目的。

嚴(yán)國富等[31]以新鮮銅藻為研究對象，采用超臨界二氧化碳法探究壓力、溫度、時間等條件分別對巖藻黃素萃取率的影響。單因素試驗發(fā)現(xiàn)對萃取率的影響因素依次是：萃取壓力＞萃取時間＞夾帶劑加入量＞萃取溫度；正交試驗得出在35℃、夾帶劑加入量200 mL、萃取壓力27.5MPa、萃取3h時，巖藻黃素萃取率為0.08%。張怡評等[32]以銅藻為研究對象，使用超臨界流體萃取巖藻黃素的最佳試驗條件為：樣品粉碎粒度80目、萃取溫度40℃、萃取壓力25MPa、萃取時間30 min，此條件下巖藻黃素提取率1.12 mg/g。Quitain等[33]以裙帶菜為研究對象，得到巖藻黃素的最佳工藝條件為：萃取溫度40℃，萃取壓力40 MPa，萃取時間180 min，巖藻黃素的回收率接近80%。

綜上可見，超臨界流體萃取法具有提取工藝簡單、對提取物的熱敏成分無不良影響、提取過程綠色環(huán)保等優(yōu)點。

1.5 其它方法

除上述常用的提取方法，還有一些其它提取方法。如曲榮榮[34]以新鮮海帶為原料研究微生物固態(tài)發(fā)酵法提取巖藻黃素的最優(yōu)菌種，并進(jìn)行了單因素影響試驗。結(jié)果顯示對海帶有最好發(fā)酵效果的是納豆菌，在37℃、時間3 d、接種量8%的條件下，巖藻黃素得率為1.18 mg/g，提取率達(dá)84.3%，比發(fā)酵前提取率提高了25.5%。王銀羽[35]利用加速溶劑萃取法，以鼠尾藻為研究對象，對巖藻黃素的最佳提取條件進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示最佳提取條件為：萃取時間12 min，萃取溫度50℃～60℃，循環(huán)2次，巖藻黃素提取率為6.97 μg/g。Kim等[36]采用液相色譜-正離子大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜和核磁共振方法，從三角褐指藻中分離并鑒定巖藻黃素。Shang等[37]采用加壓溶劑萃取法從褐藻海帶中提取巖藻黃素，考察了溫度、乙醇濃度、靜態(tài)時間、壓力等對巖藻黃素提取率的影響，發(fā)現(xiàn)在溫度110℃、90%乙醇條件下巖藻黃素提取率最大，可達(dá)0.42 mg/g。此外，Akyil等[38]利用傳統(tǒng)的溶劑萃取、超聲和微波輔助提取技術(shù)，從三角褐指藻中提取巖藻黃素，結(jié)果表明傳統(tǒng)的溶劑萃取是最有效的提取方法，巖藻黃素含量為（5.60±0.07）mg/g。

2 分離純化方法

從海藻中提取出來的巖藻黃素，多為伴有蛋白質(zhì)或者其它小分子物質(zhì)的粗品，因此還需進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化處理。

2.1 硅膠柱層析法

柱層析根據(jù)物質(zhì)具有不同物理化學(xué)性質(zhì)，因而在吸附劑中具有不同的移動速度而達(dá)到對物質(zhì)進(jìn)行分離純化的目的[39]。在分離純化巖藻黃素粗品過程中，柱層析是最常用的方法之一。

汪曙暉等[40]利用硅膠柱層析對從褐藻中提取的總色素進(jìn)行分離純化處理，得到巖藻黃素純度達(dá)88%以上。唐晨等[41]將巖藻黃素濃縮液過硅膠柱進(jìn)行純化處理，得巖藻黃素純度為90.6%。陳建楠等[42]以球等鞭金藻提取的巖藻黃素為研究對象，采用正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇（體積比9∶2∶1）作為硅膠柱洗脫液，經(jīng)硅膠柱色譜對粗色素進(jìn)行純化后，測得巖藻黃素濃縮液的回收率為86.35%，純度29.78%。此外，吳素煌[43]利用硅膠柱層析對巖藻黃素粗品進(jìn)行分離純化，采用石油醚∶乙酸乙酯（體積比）從10∶1到1∶2進(jìn)行洗脫。周衛(wèi)松[44]通過單因素和正交試驗優(yōu)化了從裙帶菜中提取巖藻黃素的提取條件，采用硅膠柱層析分離純化，以正己烷∶乙醚（85∶15，體積比）為洗脫劑，進(jìn)樣量25.0 mg/mL床層體積，結(jié)果巖藻黃素提取率為0.08%。

2.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法是在分離純化、定性定量中應(yīng)用較多的方法，其具有專屬性強(qiáng)、分離效果好、準(zhǔn)確度高、操作簡便等優(yōu)點。陳顥等[45]采用高效液相色譜法，以硅藻土為柱填料，分離純化海帶、巨藻、馬尾藻中的巖藻黃素，得到巖藻黃素的純度分別為94.77%、90.07%、75.72%。

2.3 薄層色譜法

李丹彤等[46]以裙帶菜為研究對象，采用薄層層析技術(shù)對巖藻黃素粗提液進(jìn)行分離純化，并通過萃取、反復(fù)薄層層析法使巖藻黃素的純化效率高達(dá)98.90%。Gaurav等[47]采用薄層色譜法對從褐藻Himanthalia elongata中得到巖藻黃素粗提物進(jìn)行分離純化。任丹丹等[48]采用薄層色譜法對從萱藻中得到的類胡蘿卜素組分進(jìn)行分離純化，以正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮∶無水甲醇（體積比27∶4∶2∶2）為展開劑，得到巖藻黃素。

2.4 高速逆流色譜法

高速逆流色譜法因不需要固體載體[49]，在天然活性成分的分離純化中應(yīng)用廣泛[50]。Xiao等[51]采用高速逆流色譜法分別從15.0 g干燥羊棲菜、1.5 g干燥裙帶菜和25.0 g新鮮海帶中分離純化得到巖藻黃素分別為0.20、1.09、0.83 mg，經(jīng)高效液相色譜法測得巖藻黃素純度高于90%，充分顯示了該方法具有分離速度快、純化效率高、操作簡便等優(yōu)點。

2.5 其它方法

劉麗平[52]采用大孔吸附樹脂分離純化從羊棲菜中得到的巖藻黃素粗品，通過優(yōu)化上樣濃度、上樣體積、洗脫體積等條件，得到巖藻黃素純度為8.57%，回收率為83.29%。

Kim等[53]利用離心分配色譜法從海帶中分離純化巖藻黃素，結(jié)果顯示，第1次離心分配后巖藻黃素的純度約為81%，第2次離心分配后純度超過98%。

3 含量測定方法

巖藻黃素的含量測定方法有紫外可見光譜法、核磁共振氫譜法、質(zhì)譜法、薄層層析色譜法及高效液相色譜法等，其中高效液相色譜法是最常用的方法之一。

花汝鳳等[54]采用高效液相色譜法建立了海帶中巖藻黃素的含量測定方法。Foo等[55]采用高效液相色譜法對不同藻類中的巖藻黃素進(jìn)行了定量研究。高捷等[56]建立了東海鼠尾藻中巖藻黃素含量測定的高效液相色譜法。此外，劉小芳等[57]采用反相高效液相色譜法測定新鮮及干制褐藻中巖藻黃素的含量，測得新鮮海帶和馬尾藻的巖藻黃素含量分別為559.2 mg/kg和680.4 mg/kg。王添嬌[58]采用高效液相色譜法，通過梯度洗脫對裙帶菜中巖藻黃素進(jìn)行定量檢測，測得裙帶菜中巖藻黃素提取液的濃度為717 μg/mL。

此外，還有研究采用色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對巖藻黃素進(jìn)行含量測定。鄭立洋等[59]采用高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用方法建立了5種色素（葉綠素a、葉綠素b、β-胡蘿卜素、葉黃素和巖藻黃素）的定量分析方法，并利用該方法比較了赤潮異彎藻、卡羅藻、微小原甲藻、微擬球藻、蛋白核小球藻、顆石藻、定鞭金藻、中肋骨條藻、威氏海鏈藻和假微型海鏈藻之間物種色素的分布情況。

4 結(jié)語

巖藻黃素是從海藻中提取分離獲得的活性產(chǎn)物，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化及減肥等作用。本文對巖藻黃素的提取、分離純化及含量測定方法作了簡要概述，為巖藻黃素的開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。