章婷，杜小文

（1.萬(wàn)年縣中醫(yī)院檢驗(yàn)科；江西 萬(wàn)年 335500）

血培養(yǎng)是血流感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn),但采血過程易受到污染。一個(gè)由CAP 主導(dǎo)的影響重大的研究，發(fā)現(xiàn)來(lái)自美國(guó)640 家醫(yī)院497134 例血培養(yǎng)標(biāo)本污染率平均污染率為2.5%, 常見污染菌為凝固酶陰性葡萄球菌、 微球菌、α-溶血草綠色鏈球菌、痤瘡丙酸桿菌、棒狀桿菌以及芽孢桿菌[1,2]。

污染菌產(chǎn)生的假陽(yáng)性導(dǎo)致臨床面對(duì)報(bào)告單的迷茫,也由于無(wú)對(duì)應(yīng)的癥狀和治療容易引起患者的抱怨和投訴。血培養(yǎng)污染的原因主要有：采血人員無(wú)菌意識(shí)差；采血環(huán)境不達(dá)標(biāo)，穿刺間空氣消毒不合格；皮膚消毒不規(guī)范不徹底；培養(yǎng)瓶瓶塞穿刺區(qū)消毒不規(guī)范不徹底,且采血的皮膚消毒過程不可能做到無(wú)菌，因?yàn)榧s20%的細(xì)菌隱藏在汗液的毛孔、毛囊及表皮和真皮深層的其它結(jié)構(gòu)中[3]，目前的醫(yī)療環(huán)境, 這些問題是很難在短時(shí)間內(nèi)得到改善的,而PG、LPS 和BG 檢測(cè)是目前檢測(cè)血流感染的新的血清學(xué)方法,通過這3 個(gè)標(biāo)志物的檢測(cè)可以區(qū)分革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌和真菌引起的血流感染，具有早期診斷以及連續(xù)檢測(cè)等特點(diǎn)[4-6]，但是采血過程引入的污染菌是否同樣會(huì)對(duì)其造成干擾,尚無(wú)人研究。本研究通過制備模擬臨床采血污染樣本,進(jìn)行血培養(yǎng)和血流感染三聯(lián)檢的檢測(cè)及污染樣本菌繁殖情況分析,對(duì)培養(yǎng)法和生化檢測(cè)常見污染菌的干擾情況進(jìn)行評(píng)估,為臨床使用相關(guān)方法學(xué)檢測(cè)應(yīng)注意的事項(xiàng)提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 菌株 共分為 3 類。Ⅰ.G+表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis ATCC12228、 葡萄球菌人亞種Staphylococcus hominis ATPQ15020、藤黃微球菌Micrococcus luteusCMCC(B)28001、血鏈球菌Streptococcus sanguis ATCC10556、 痤瘡丙酸桿菌Propionibacterium acnes ATCC6919、假白喉棒狀桿菌Corynebacterium pseudodiphtheriticum ATCC10 700、 解淀粉芽孢桿菌 Bacillus amyloliquefaciensATJD161125 Ⅱ.G-鮑曼不動(dòng)桿菌 Acinetobacter baumannii ATCC19606,洋蔥伯克霍爾德菌Burkholderia cepacia ATCC25608, 嗜麥芽窄食單胞菌Stenotrophomonas maltophilia ATCC17666；Ⅲ.真 菌煙曲霉Aspergillus fumigatus CICC40167、宛氏擬青霉Paecilomyces variotii ATCC18502，所有標(biāo) 2.試劑及儀器：生物安全柜 1300 SERIES A2,購(gòu)自Thermo Scientific；CO2培養(yǎng)箱 HERACELL 150I,購(gòu)自 Thermo Scientific；厭氧產(chǎn)氣袋 AnaeroGen 2.5 L，購(gòu)自Thermo Scientific，比濁儀 PLASTIC plus，購(gòu)自生物梅里埃；血球計(jì)數(shù)板，采購(gòu)自上海求精生化試劑儀器有限公司；0.9%氯化鈉注射液購(gòu)自山東齊都藥業(yè)有限公司；手工血培養(yǎng)瓶、沙保羅瓊脂平板、血瓊脂平板，購(gòu)自鄭州安圖生物工程股份有限公司；血流感染三聯(lián)檢革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌肽聚糖檢測(cè)試劑盒（顯色法）、革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒（顯色法）、真菌（1-3）-β-D-葡聚糖檢測(cè)試劑盒（顯色法）來(lái)自于鄭州安圖生物工程股份有限公司，檢測(cè)儀器為全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀， 購(gòu)置自安圖實(shí)驗(yàn)儀器（鄭州）有限公司。

1.3 檢測(cè)方法 ⑴菌液制備 提前將菌株活化，轉(zhuǎn)接第二代備用。用接種環(huán)挑取菌落，用0.9%氯化鈉注射液將G+菌和G-菌在比濁管中進(jìn)行稀釋，先用比濁儀制備成0.5 麥?zhǔn)暇海舛劝凑?08CFU/ml 進(jìn)行計(jì)算）， 再用0.9%氯化鈉 注射液稀釋到102CFU/ml(H)和 101CFU/ml(L)兩個(gè)濃度（取 102CFU/ml 菌懸液100μl 涂血平板計(jì)數(shù)； 煙曲霉以及宛氏擬青霉制備成分生孢子懸濁液后用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)， 用0.9%氯化鈉注射液稀釋到5*102CFU/ml(H)和 5*101CFU/ml(L)兩個(gè)濃度，取 5*102CFU/ml 菌懸液100μl 涂平板菌落計(jì)數(shù)。⑵模擬血液污染菌樣本制備 新鮮血液來(lái)自8 名志愿者， 近期均無(wú)發(fā)熱等感染癥狀，近一周未服用抗菌藥物。嚴(yán)格按照規(guī)范采血要求將血液抽取到肝素抗凝采血管中， 每管 5ml， 立即吸取 200μl 102CFU/ml、101CFU/ml 菌液分別加入到一管全血中, 接菌后輕微顛倒混勻8～10 次，每個(gè)菌高、低濃度各6 個(gè)平行，高濃度采血管編號(hào)H1～H6、 低濃度采血管編號(hào)L1～L6。⑶檢測(cè) 取 H1、H2 采血管中樣本分別加入兩個(gè)血培養(yǎng)瓶中, 取H3、H4 采血管中樣品離心后吸取上清立即進(jìn)行進(jìn)行PG、LPS、BG 的檢測(cè)，剩余的樣本顛倒混勻后與H5、H6 分成兩組， 分別放置室溫和2℃～8℃24h 后離心取上清再次進(jìn)行 PG、LPS、BG 的檢測(cè),并涂板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，每個(gè)樣本涂3 個(gè)平板。加低濃度菌液的血液樣本按照高濃度樣本進(jìn)行相同處理。以不加菌的血液為陰性對(duì)照。除血液采集及離心外, 其余操作均在潔凈條件下進(jìn)行。⑷結(jié)果判讀及統(tǒng)計(jì) 血培養(yǎng)和PG、LPS、BG 檢測(cè)的操作和結(jié)果判讀嚴(yán)格按照試劑和儀器說(shuō)明書進(jìn)行。血培養(yǎng)瓶分別對(duì)應(yīng)放入普通培養(yǎng)箱及CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，5～8 天內(nèi)觀察培養(yǎng)結(jié)果；PG、LPS、BG 三項(xiàng)檢測(cè)流程：全血樣本 4000r/min 離心10min，取上清作為三項(xiàng)的檢測(cè)樣本，取三項(xiàng)待檢樣本按照產(chǎn)品試劑盒說(shuō)明書操作進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并回算結(jié)果。分別對(duì)血培養(yǎng)結(jié)果、 平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果及PG、LPS、BG 檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 模擬樣本含菌量制備得到的模擬血污染菌樣本的含菌量高濃度約在5～40CFU 每份樣本， 低濃度約在0～5CFU 每份樣本，符合臨床實(shí)際的污染菌數(shù)量[7]（表 1）。

表1 樣本制備前菌液涂板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

2.2 血培養(yǎng)及血流感染三聯(lián)檢檢測(cè)結(jié)果分析 血培養(yǎng)模擬樣本高濃度均檢出陽(yáng)性,低濃度除痤瘡丙酸桿菌和假白喉棒狀桿菌外也檢出為陽(yáng)性，而PG、LPS 和 BG 檢測(cè)放置 0h、2～8℃24h 與室溫 24h 樣本均為陰性，且檢測(cè)值均低于檢出限，和陰性樣本對(duì)照無(wú)差異。說(shuō)明這些污染菌在常規(guī)污染量會(huì)造成血培養(yǎng)的假陽(yáng)性，而對(duì)PG、LPS 和BG 檢測(cè)無(wú)干擾。見表 2。

2.3 樣本菌落計(jì)數(shù) 放置2～8℃和室溫24h 后涂板計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)各菌株均未出現(xiàn)大量繁殖，由于計(jì)數(shù)時(shí)平板上菌落過少,計(jì)數(shù)結(jié)果不是一個(gè)特別精確的數(shù)值，但可以確定的是，每個(gè)樣本中的菌落總數(shù)進(jìn)本維持在原數(shù)量的0～10 倍范圍內(nèi)（表3）。而痤瘡丙酸桿菌室溫和2～8℃樣本、 血鏈球菌2～8℃樣本涂板未見菌生長(zhǎng),可能和血液在體外不能維持痤瘡丙酸桿菌生長(zhǎng)所需的嚴(yán)格厭氧環(huán)境相關(guān), 血鏈球菌2～8℃不生長(zhǎng)應(yīng)為其不耐低溫，導(dǎo)致菌死亡。這說(shuō)明血液并不是一個(gè)適宜菌繁殖的環(huán)境,菌株在血液中并未出現(xiàn)明顯的繁殖和代謝， 所以PG、LPS 和BG檢測(cè)為陰性是一個(gè)正常的結(jié)果。

3 討論

PG、LPS、BG 分別是 G+、G-和真菌細(xì)胞壁上的特異性多糖,其含量的增高同血流感染的發(fā)生呈高度相關(guān)。在體外診斷中，利用這三項(xiàng)標(biāo)志物同鱟變形細(xì)胞產(chǎn)物或昆蟲血淋巴中酶原級(jí)聯(lián)體系的反應(yīng)而檢測(cè)這三種標(biāo)志物在血液中的變化,也是血流感染和侵襲性真菌病診斷的一個(gè)重要的微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)[8]，其中LPS 和BG 檢測(cè)近年來(lái)已發(fā)展成為臨床用于血流感染較為廣泛的指標(biāo)。PG、LPS、BG 檢測(cè)的樣本是血清或血漿,檢測(cè)時(shí)間一般相對(duì)于血培養(yǎng)較為滯后，多在采集后2～8 個(gè)小時(shí)內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，這可能給樣本中的污染菌一個(gè)繁殖的時(shí)間,而從反應(yīng)的標(biāo)志物來(lái)說(shuō)，污染菌和目標(biāo)菌并無(wú)差異，所以說(shuō)我們研究污染菌對(duì)此方法學(xué)的干擾是十分必要的。

表2 血培養(yǎng)結(jié)果及PG、LPS、BG 檢測(cè)結(jié)果

表3 模擬臨床采血樣本2-8℃24h 及室溫24h 平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

本研究通過制備模擬臨床采血污染樣本，并對(duì)血培養(yǎng)和血流感染三聯(lián)檢的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較,可以看出正常的采血污染確實(shí)會(huì)造成血培養(yǎng)的假陽(yáng)性,但是卻不會(huì)對(duì)PG、LPS 和BG 檢測(cè)產(chǎn)生干擾。有文獻(xiàn)顯示,多種菌血培養(yǎng)的陽(yáng)性結(jié)果意義很難界定，腸球菌、不動(dòng)桿菌和其它非發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌在60%～70%的病例中是有意義的，但也有25%～30%意義是不明確的； 草綠色鏈球菌僅30%有意義；凝固酶陰性葡萄球菌更是挑戰(zhàn)，盡管只有10%～15%有臨床意義，但它檢出相對(duì)多，通常比其它菌的三倍還要多[9]。而一項(xiàng)關(guān)于醫(yī)院霉菌相與住院病人感染相關(guān)性的研究發(fā)現(xiàn),青霉在環(huán)境塵粒樣本中的分離概率是51.5%，在手術(shù)病人傷口分泌液分離菌株中占比40.4%[7]。臨床真正的微生物血流感染，微生物在血液中是不斷地生長(zhǎng)和衰亡的循環(huán)過程，而當(dāng)人體致病時(shí)，機(jī)體的免疫系統(tǒng)也處于一個(gè)失衡狀態(tài)，代謝產(chǎn)生的肽聚糖、內(nèi)毒素或葡聚糖速率超過了機(jī)體的清除速率[10]，濃度隨著疾病進(jìn)程的不同時(shí)期變化，呈現(xiàn)一個(gè)先升高，到達(dá)高點(diǎn)，再下降最終徹底康復(fù)后回復(fù)平衡的狀態(tài),因此臨床真正的血流感染肽聚糖、內(nèi)毒素或葡聚糖檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，且檢測(cè)值的高低和感染的程度相關(guān)，而血液離體后,體內(nèi)的免疫細(xì)胞還會(huì)在一段時(shí)間內(nèi)維持活性,污染菌入血后受人體血液系統(tǒng)的免疫系統(tǒng)影響,很快被吞噬殺死或者處于靜態(tài)存活，不能持續(xù)繁殖，且菌量很低且不持續(xù)， 產(chǎn)生的特異性多糖片段被溶菌酶等進(jìn)一步分解成無(wú)法識(shí)別的片段[11]，因此不會(huì)造成血檢三項(xiàng)檢測(cè)干擾， 但這些污染菌如果進(jìn)入血培養(yǎng)瓶,血培養(yǎng)瓶豐富的培養(yǎng)基質(zhì)會(huì)讓其迅速生長(zhǎng)繁殖,血瓶的內(nèi)部環(huán)境也會(huì)裂解一部分免疫細(xì)胞,滅活一部分免疫因子，因而血培養(yǎng)為陽(yáng)性。因此，傳統(tǒng)的血培養(yǎng)無(wú)法規(guī)避也無(wú)法區(qū)分污染菌， 而PG、LPS 和BG 檢測(cè)可以很好的避免污染菌造成的干擾，提高血流感染檢測(cè)的準(zhǔn)確率。