馬金平，王雅莉，婁歡，李紅娟

（鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院婦科，河南 鄭州 450000）

細胞因子或者癌基因水平的改變,能夠影響到柱狀上皮的早期異常分裂過程,最終促進宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[1]。生長因子調(diào)控蛋白的波動能影響癌基因的激活,加劇癌基因?qū)δ[瘤增殖的影響[2]。堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）是生長因子家族成員，其對于下游癌細胞內(nèi)信號通路的上調(diào)作用,能夠促進腫瘤信號通路蛋白的交錯激活,促進了癌細胞對于局部癌旁組織的侵襲[3]。有部分研究者探討了b FGF 在宮頸癌患者中的表達情況,認為在宮頸癌患者中，bFGF 蛋白的表達濃度明顯上升[4]，但關(guān)于其與宮頸癌患者體內(nèi)高危型人乳頭瘤狀病毒 （HRHPV）載量關(guān)系的研究甚少。本研究探討了宮頸癌組織bFGF 表達情況及其與宮頸癌病理學(xué)特征、高危型人乳頭瘤狀病毒（HR-HPV）病毒載量的關(guān)系，旨在為宮頸癌的發(fā)生發(fā)展機制提供參考依據(jù)。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象的資料情況 選取 2018 年 1 月-2019 年1 月病理科收集的90 例宮頸癌組織作為宮頸癌組,癌旁組織標(biāo)本為對照組。年齡44～65 歲，平均54.3±7.4 歲,依據(jù)國際婦產(chǎn)聯(lián)盟分期(FIGO)標(biāo)準(zhǔn)：其中Ⅰ期宮頸癌22 例，Ⅱ期宮頸癌42 例，Ⅲ期宮頸癌20 例，Ⅳ期宮頸癌6 例；宮頸癌組織病理學(xué)分化情況：高、中、低分化患者分別為31 例、35例、24 例；其中檢測出淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者39 例；肌層浸潤深度≥1/2 的宮頸癌患者有35 例；腫瘤病灶：≥3.0 cm 47 例。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴符合中華婦產(chǎn)科學(xué)會制定的《宮頸癌診斷與治療指南(第四版)》中的宮頸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；⑵經(jīng)病理學(xué)檢查證實,病理診斷標(biāo)準(zhǔn)符合中華醫(yī)學(xué)會病理學(xué)分會女性生殖系統(tǒng)疾病學(xué)組及中國優(yōu)生科學(xué)協(xié)會陰道鏡與宮頸病理學(xué)會病理學(xué)組發(fā)布的 《宮頸癌及癌前病變病理診斷規(guī)范》中規(guī)定的取材、操作及診斷標(biāo)準(zhǔn)；⑶均為首次診斷的患者，既往無放化療史；⑷本研究符合《赫爾透辛基宣言》相關(guān)醫(yī)學(xué)倫理規(guī)定，并經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴伴有其他部位的惡性腫瘤；⑵手術(shù)后復(fù)發(fā)的宮頸癌患者；⑶甲狀腺功能障礙患者；⑷合并宮頸、生殖系統(tǒng)其他重大疾病的宮頸癌患者。

1.3 免疫組化檢測 采用石蠟切片，脫水操作后采用3%H2O2室溫條件下孵育20min， 磷酸鹽緩沖液清洗3 次，每次5min，磷酸鹽緩沖液稀釋后的山羊血清封閉抗體5min，倒去血清后不清洗，加入一抗（購自賽默飛世爾中國 濃度：1：1000）5ml，37℃孵育2h，或者放置4℃冰箱過夜孵育，磷酸鹽緩沖液清洗3 次,每次5min,加入生物素?zé)晒鈽?biāo)記的二抗（購自賽默飛世爾中國 濃度：1：2000）3ml，37℃孵 育20～30min，磷酸鹽緩沖液清洗 3 次，每次 5min，加入Streptavidin/HRP 辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，37℃孵育20～30min,磷酸鹽緩沖液清洗3 次,每次5min,增強型HRP-DAB 底物顯色試劑盒 (PA110)顯色，自來水沖洗，復(fù)染，封片。

bFGF 蛋白主要表達在宮頸癌組織細胞的細胞漿，顯微鏡下觀察呈黃色、棕黃色、褐色則表現(xiàn)為陽性表達[9]，⑴依據(jù)bFGF 蛋白陽性染色強度：無色(0 分)、淡黃色(1 分)、棕黃色(2 分)、褐色(3 分)；⑵bFGF 蛋白陽性表達細胞占視野下所有細胞的比例：占比≤10%為 1 分、占比范圍 11%～50%(2 分)、占比范圍 51%～75%(3 分)、占比范圍＞75%(4 分)，染色強度與陽性染色細胞占比范圍積分的乘積為總分，總分＜3 分為陰性、≧3 分為陽性。

1.3 HC2-HPV-DNA 檢測及評價 常規(guī)窺器暴露宮頸后,將HPV 采樣刷放置于宮頸口按逆時針轉(zhuǎn)3圈,并停留10s。將需要部分采樣刷留在標(biāo)本儲藏瓶中，密閉后做好標(biāo)記并送檢。采用雜交捕獲法并應(yīng)用基因雜交信號放大系統(tǒng)（DML2000TM,美國Digene 公司提供） 進行 HC2-HPV-DNA 檢測，HPV試劑盒為上海萊特公司提供,嚴格按照說明書進行操作。以光量讀數(shù)與陰性測定值的比值（RLU/CO）對HPV 病毒載量進行劃分, 由于RLU/CO 離散度較大，因此對其進行常用對數(shù)轉(zhuǎn)換（即lg RLU/CO）將 HPV 病毒載量分為＜1,1～＜2，2～＜3，≥3 四個等級。HR-HPV 載量分析：同一級別宮頸病變，HPV載量越高,患病的危險度越高；不同級別宮頸病變，HPV 載量越高，患高級別病變的危險度越高。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 本研究收集的所有數(shù)據(jù)均在SPSS21.0 中進行統(tǒng)計分析，年齡采用進行統(tǒng)計描述，數(shù)據(jù)比較分析應(yīng)用t 檢驗；χ2檢驗分析bFGF蛋白陽性表達率；bFGF 蛋白陽性表達率與HRHPV 病毒載量的關(guān)系采用Mann-Whitney U 檢驗；P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。

2 結(jié)果

2.1 兩組bFGF 蛋白陽性表達率比較 宮頸癌組bFGF 蛋白陽性表達率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表 1。

2.2 宮頸癌組織中的bFGF 蛋白陽性表達率與患者臨床病理特征的關(guān)系 不同F(xiàn)IGO 分期、 是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者癌組織中bFGF 蛋白陽性表達率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；不同組織學(xué)分化程度、分型、不同病灶大小、不同肌層浸潤深度的宮頸癌組織中bFGF 蛋白陽性表達率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表 2。

表1 二組bFGF 蛋白陽性表達率比較

表2 宮頸癌組織中的bFGF 蛋白陽性表達率與患者病理學(xué)特征的關(guān)系

2.3 宮頸癌組織中的bFGF 蛋白陽性表達率與HR-HPV 病毒載量的關(guān)系 宮頸癌組織中bFGF蛋白陽性表達與陰性表達者HR-HPV 病毒載量的總體分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）見表3。

3 討論

表3 宮頸癌組織中的bFGF 蛋白陽性表達率與HR-HPV 病毒載量的關(guān)系

高危型HPV 病毒特別是HPV16、HPV18 病毒感染，能顯著促進宮頸柱狀上皮細胞異常分裂，在E6/E7 蛋白高度整合宿主細胞的過程中, 高危型HPV 感染導(dǎo)致的宮頸癌發(fā)病率持續(xù)上升[6]。臨床上宮頸癌患者的中晚期階段病情進展速度較快，遠期帶瘤生存時間較短,宮頸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險較高[7,8]?，F(xiàn)階段缺乏對宮頸癌綜合性病情評估的可靠指標(biāo)，雖然鱗狀上皮細胞抗原能發(fā)揮一定作用，但評估宮頸癌臨床病理特征的滿意度仍然較低[9,10]。本次研究通過對宮頸癌患者病灶組織中bFGF 蛋白的表達進行分析研究,不僅能深入揭示宮頸癌發(fā)生發(fā)展的可能機制,而且還能為宮頸癌臨床病理特征或者綜合性病情評估提供依據(jù)。

bFGF 蛋白主要表達于間質(zhì)組織、胚胎組織及未分化成熟組織中，在炎癥、損傷修復(fù)或者惡性腫瘤患者中，由于機體反饋性調(diào)節(jié)系統(tǒng)的激活，bFGF蛋白的表達濃度均可顯著上升。bFGF 蛋白對上皮細胞增殖狀態(tài)的誘導(dǎo)作用能提高上皮細胞的擴增風(fēng)險，抑制早期癌細胞的凋亡。部分學(xué)者的研究認為bFGF 蛋白的高表達能夠促進卵巢癌或者子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生[11]，但關(guān)于其與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系研究較少，同時未能深入揭示bFGF 蛋白與HR-HPV 的關(guān)系。

本研究免疫組化結(jié)果提示,宮頸癌組織中bFG F 蛋白陽性表達率明顯高于癌旁組織。bFGF 蛋白的高表達主要在腫瘤生物學(xué)特征惡化、腫瘤信號通路激活或者癌基因損傷修復(fù)方面發(fā)揮作用,進而持續(xù)維持癌細胞的增殖轉(zhuǎn)錄過程。有研究發(fā)現(xiàn),在宮頸癌組織中,bFGF 蛋白陽性表達率可超過65%，而在有明顯的宮旁組織或盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，bFGF 蛋白陽性表達率可進一步升高[12,13]，提示bFGF 蛋白陽性表達能顯著加劇宮頸癌進展。分析原因可能與bFGF 蛋白高表達能提高腫瘤細胞浸潤范圍，促進其對陰道壁或?qū)m旁組織的侵襲，最終促進宮頸癌進展有關(guān)；而bFGF 蛋白對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響, 主要在于其能提高淋巴結(jié)內(nèi)皮黏附分子snail 的激活程度，而最終促進淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生。而本研究結(jié)果顯示，bFGF 蛋白表達并不會影響癌細胞的分化過程。

宮頸癌組織bFGF 蛋白陽性表達的患者中，HR-HPV 病毒載量較高,表明宮頸癌患者HR-HPV病毒載量可能影響bFGF 蛋白的表達。而以往研究認為，HPV E6 蛋白是HR-HPV 的主要轉(zhuǎn)化蛋白，主要通過使P53 泛素化分解而使其失去對細胞生長的負調(diào)節(jié)作用,最終引起細胞過度增生并向惡性轉(zhuǎn)化[14-16]。HR-HPV 可能就是通過P53 調(diào)節(jié)通路上調(diào)bFGF 蛋白表達，而顯著加劇病毒顆粒基因?qū)τ趯m頸細胞的整合程度,進而導(dǎo)致宮頸上皮細胞的癌變過程, 這也可能是HR-HPV 導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生發(fā)展的機制之一[17], 但仍有待進一步的研究予以證實。

綜上所述，bFGF 蛋白在宮頸癌組織中呈高表達，與FIGO 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)，HRHPV 可能通過上調(diào)bFGF 蛋白表達而促進宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。