黃韜 ，羅清 ，徐榮 ，曾文興 ，李俊明

（1.宜春市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 宜春 336000；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330000）

乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）是臨床上應(yīng)用最為廣泛的判斷HBV 感染血清學(xué)標(biāo)志物之一,也是WHO 推薦的診斷HBV 感染的核心指標(biāo)。目前較為主流的HBsAg 檢測方法為化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）和酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）?；瘜W(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法（CMIA）是化學(xué)發(fā)光法的一種,由于具有檢測靈活、自動化程度高和更易實(shí)現(xiàn)檢驗(yàn)過程的標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)勢,CLIA 在臨床上的普及率越來越高。近年來, 已有一些研究對CLIA 和ELISA 技術(shù)在檢測HBV 血清學(xué)標(biāo)志物方面的性能進(jìn)行了比較, 研究結(jié)果均提示與ELISA 技術(shù)相比,CLIA 具有更高的檢測靈敏度和更好的精密度[1-3]。然而,HBsAg 檢測靈敏度的提高不可避免的會帶來一些新的困擾,如少見模式結(jié)果增多、弱反應(yīng)性結(jié)果、甚至部分假陽性結(jié)果的增多等,目前很少有研究探討CLIA 和ELISA 技術(shù)檢測出的弱反應(yīng)性結(jié)果的可靠性。

本研究旨在評價化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法（CMIA）對乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）弱反應(yīng)性血清標(biāo)本的檢測性能,以期對臨床檢驗(yàn)工作提供一定的指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 所有標(biāo)本選自 2016 年 10 月至2018 年12 月期間在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的患者,其中CMIA 檢測HBsAg 弱反應(yīng)性標(biāo)本的納入標(biāo)準(zhǔn)為：CMIA 檢測濃度為 0.05～0.50IU/mL；ELI SA 檢測HBsAg 弱反應(yīng)性標(biāo)本的納入標(biāo)準(zhǔn)為：ELISA 檢測 S/CO 為 1～4,血清標(biāo)本分析前、分析中處理嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程,收集到的血清標(biāo)本置于-20℃保存。

1.2 儀器與試劑 CMIA 分析系統(tǒng)：Architect i2000微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析儀, 配套HBsAg 定量檢測試劑盒、校準(zhǔn)品均由雅培公司生產(chǎn)。ELISA 分析系統(tǒng)：乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒（ELISA)由廈門英科新創(chuàng)科技有限公司生產(chǎn), 鄭州安圖DH OMO 酶標(biāo)儀,DEM-3 型自動洗板機(jī)。中和確認(rèn)試驗(yàn)檢測系統(tǒng)：Architect i2000 微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析儀,配套HBsAg 定量檢測試劑盒、校準(zhǔn)品、HB-sAg 確認(rèn)試劑盒均由雅培公司生產(chǎn)。研究過程中每批次檢測均采用鄭州標(biāo)源生物工程股份有限公司生產(chǎn)的HBsAg 血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.3 方法

1.3.1 通過檢索檢驗(yàn)信息系統(tǒng)中的數(shù)據(jù) 統(tǒng)計分析2018 年7 月至2018 年10 月在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診就診患者 （排除感染科門診就診患者）CMIA 和ELISA 檢測血清HBsAg 的陽性率,初步了解兩種方法檢測HBsAg 敏感性差異。

1.3.2 HBsAg 弱反應(yīng)性血清標(biāo)本的平行檢測及結(jié)果確認(rèn) 將篩選出的183 例CMIA 檢測弱反應(yīng)性標(biāo)本,嚴(yán)格按照乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒（ELISA)試劑說明書進(jìn)行HBsAg 的檢測。按照中和確認(rèn)試驗(yàn)試劑使用說明書,對183 例弱反應(yīng)性標(biāo)本在Architect i2000 微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析儀上進(jìn)行結(jié)果確認(rèn)。

將篩選出的50 例ELISA 檢測弱反應(yīng)性標(biāo)本,嚴(yán)格按照Architect i2000 微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及其配套試劑的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行HBsAg 的檢測。按照中和確認(rèn)試驗(yàn)試劑使用說明書,對標(biāo)本在Architect i2000 微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析儀上進(jìn)行結(jié)果確認(rèn)。

1.3.3 根據(jù)EP-15A2 文件[4],選擇一份 HBsAg 弱反應(yīng)性的臨床血清標(biāo)本,對該標(biāo)本用CMIA 法進(jìn)行連續(xù)5 天的重復(fù)檢測,每天重復(fù)檢測4 次,獲得共20個檢測結(jié)果。分析CMIA 檢測弱反應(yīng)性血清標(biāo)本的精密度。

1.4 使用統(tǒng)計軟件 SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析 對CMIA 和ELISA 檢測HBsAg 的陽性率差異采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2018 年 7 月至 2018 年 10 月期間, 南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科接收申請HBsAg 檢驗(yàn)的門診就診患者血清標(biāo)本共計55737 例。其中采用CMIA檢測標(biāo)本47411 例,檢測結(jié)果為有反應(yīng)性血清標(biāo)本9957 例,陽性率為21%；采用ELISA 檢測標(biāo)本8326例, 檢測結(jié)果為陽性血清樣本1533 例, 陽性率為18.4%。兩種檢測方法檢測結(jié)果經(jīng)卡方檢驗(yàn)統(tǒng)計分析,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,P=0.032。

CMIA 檢測為HBsAg 弱反應(yīng)性標(biāo)本的ELISA法檢測結(jié)果，見表1。

183 例CMIA 檢測HBsAg 結(jié)果為弱反應(yīng)性的血清標(biāo)本,對這些標(biāo)本采用ELISA 方法進(jìn)行平行檢測。結(jié)果顯示ELISA 檢出的陽性標(biāo)本數(shù)為88 例,陽性率 48.09%（88/183）。

以特異性抗體中和確認(rèn)試驗(yàn)作為金標(biāo)準(zhǔn)對此183 例血清標(biāo)本進(jìn)行的確認(rèn)檢測結(jié)果顯示, 其中168 例為HBsAg 確認(rèn)陽性。CMIA 檢測弱反應(yīng)性HBsAg 標(biāo)本的陽性預(yù)測值為91.80%。ELISA 檢測弱反應(yīng)性HBsAg 標(biāo)本的敏感性為52.38%, 但陽性預(yù)測值達(dá)100%。

表1 183 例HBsAg 弱反應(yīng)性標(biāo)本各種方法結(jié)果比對

CMIA 檢測值大于或等于0.16IU/mL 的標(biāo)本,中和確認(rèn)試驗(yàn)100%為陽性。

ELISA 檢測為HBsAg 弱反應(yīng)性標(biāo)本的CMIA法檢測結(jié)果。本研究納入的50 例ELISA 檢測為HBsAg 弱反應(yīng)性的血清標(biāo)本,對這些標(biāo)本采用CMI A 檢測系統(tǒng)進(jìn)行平行檢測。CMIA 的檢測結(jié)果顯示其中47 例為有反應(yīng)性標(biāo)本,3 例為非反應(yīng)性標(biāo)本。中和確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果顯示,47 例CMIA 法顯示有反應(yīng)性的標(biāo)本HBsAg 均確認(rèn)為陽性。3 例兩種方法檢測結(jié)果不一致的標(biāo)本均為陰性。47 例HBsAg 檢測結(jié)果為有反應(yīng)性標(biāo)本的CMIA 檢測值均大于0.16 IU/mL。

根據(jù)EP-15A2 文件, CMIA 檢測該弱反應(yīng)性血清標(biāo)本的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差Sr 和變異系數(shù)分別為0.010 和5.06%, 中間精密度標(biāo)準(zhǔn)差SI 和變異系數(shù)分別為0.011 和5.56%, 均小于廠家聲稱值。見表2。

表2 精密度檢測結(jié)果

3 討論

血清中HBsAg 呈現(xiàn)弱反應(yīng)性的原因有很多種,可能與窗口期、急性感染后期、低水平攜帶者、慢性HBV 感染者、HBV 基因突變或變異者、 合并HCV 和 （或）HDV 感染導(dǎo)致的 HBV 復(fù)制和 （或）HBsAg 表達(dá)干擾等有關(guān)[5]。HBsAg 弱反應(yīng)性標(biāo)本的準(zhǔn)確及時檢出在提高乙型肝炎窗口期的發(fā)現(xiàn)率、流行病學(xué)研究、乙型肝炎的預(yù)防、保證輸血安全和控制院內(nèi)感染以及隱匿性乙型肝炎的診斷等方面發(fā)揮著舉足輕重的作用[6-10]。

ELISA 對HBsAg 的檢測是一種固相酶聯(lián)免疫測定方法,在微孔條上預(yù)包被純化的抗乙型肝炎病毒表面抗體（HBsAb）,配以酶標(biāo)記抗體（HBsAb-HRP）,采用夾心法原理檢測人血清（或血漿）中的HBsAg,通過酶與底物發(fā)生顏色反應(yīng)的深淺來判讀HBsAg 的水平。ELISA 是一種定性或半定量的檢測方法。該方法具有檢測靈敏度較高、成本低、對環(huán)境污染少等優(yōu)點(diǎn),但是亦存在著操作繁瑣、耗時長、影響因素多、質(zhì)量控制難、低濃度樣本易漏檢、難以定量等缺點(diǎn)[11]。

CMIA 對HBsAg 的檢測是一種將化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)與免疫反應(yīng)相結(jié)合的定量分析方法。首先,標(biāo)本和 HBsAb 包被的順磁微粒子結(jié)合,洗滌；第二步,加入吖啶酯標(biāo)記的HBsAb 的結(jié)合物,再次洗滌；最后,加入預(yù)觸發(fā)液和觸發(fā)液,復(fù)合物中的吖啶酯被氧化直接發(fā)光, 標(biāo)本中的HBsAg 含量與光學(xué)系統(tǒng)所檢測到的相對發(fā)光強(qiáng)度(RLU)呈正比。與ELI SA 相比較,該方法具有靈敏度高、可準(zhǔn)確定量、影響因素少、重復(fù)性好、易于標(biāo)準(zhǔn)化、檢測靈活、自動化程度高等優(yōu)點(diǎn)[12]。

在本研究中, 重點(diǎn)對HBsAg 弱反應(yīng)性標(biāo)本進(jìn)行分析和討論。對183 例CMIA 檢測HBsAg 呈弱反應(yīng)性的標(biāo)本進(jìn)行ELISA 平行檢測和中和確認(rèn)試驗(yàn)檢測,結(jié)果顯示CMIA 檢測陽性預(yù)測值91.80%；ELISA 檢測敏感性52.38%,陽性預(yù)測值100%。對50 例 ELISA 檢測 HBsAg 呈弱反應(yīng)性標(biāo)本進(jìn)行CMIA 平行檢測和中和確認(rèn)試驗(yàn)檢測,結(jié)果顯示47例標(biāo)本確認(rèn)為陽性,3 例兩種方法檢測結(jié)果不一致的標(biāo)本均為陰性。同時,精密度分析結(jié)果顯示,CMIA檢測弱反應(yīng)性血清標(biāo)本的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差Sr 和變異系數(shù)分別為0.010 和5.06%, 中間精密度標(biāo)準(zhǔn)差SI和變異系數(shù)分別為0.011 和5.56%, 均小于廠家聲稱值。由此可以得出,對于HBsAg 弱反應(yīng)性血清標(biāo)本,CMIA 不僅具有更高的敏感性,同時也具有很高的可靠性和精密度。故推薦使用CMIA 對HBsAg 弱反應(yīng)性標(biāo)本進(jìn)行檢測,避免漏診和誤診。

對230 例CMIA 檢測為HBsAg 弱反應(yīng)性的標(biāo)本進(jìn)行分段分析的結(jié)果顯示, 當(dāng)HBsAg 檢測值大于或等于0.16IU/mL 時, 中和確認(rèn)試驗(yàn)100%為陽性, 檢測結(jié)果的特異性達(dá)100%。因此, 我們認(rèn)為CMIA 檢測 HBsAg 濃度大于或等于 0.16IU/mL,假陽性存在的可能性非常小,無需確認(rèn)試驗(yàn)即可發(fā)出HBsAg 陽性的檢測報告。而當(dāng) HBsAg 濃度小于0.16IU/mL, 建議應(yīng)用中和確認(rèn)試驗(yàn)以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。在本研究中,CMIA 和ELISA 同時檢測HBsAg 為陽性時,確認(rèn)試驗(yàn)陽性率 100%。因此,如果實(shí)驗(yàn)室條件不允許對血清標(biāo)本進(jìn)行中和確認(rèn)試驗(yàn), 建議嘗試加做ELISA 檢測, 檢測結(jié)果若為ELI SA 同時陽性,那么可報告高度懷疑HBsAg 陽性。

HBsAg 檢測有內(nèi)源性和外源性兩種因素影響導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)。ELISA 檢測的內(nèi)源性干擾因素包括類風(fēng)濕因子（RF）、各種補(bǔ)體、高濃度的非特異性免疫球蛋白,易嗜性抗體、某些特殊的自身抗體、外源性人抗鼠抗體以及交叉反應(yīng)物質(zhì)等。外源性干擾因素主要包括標(biāo)本溶血、振蕩的溫度和時間、試劑的質(zhì)量的參差不齊、細(xì)菌對血清的污染、操作過程中的清洗不徹底,標(biāo)本離心不充分含有纖維蛋白絲等[13-15]。CMIA 在保證標(biāo)本離心分離效果,排除嚴(yán)重溶血標(biāo)本等外源性干擾因素后,強(qiáng)調(diào)接受小鼠單克隆抗體制劑診斷或治療的患者,樣本中可能出現(xiàn)的人抗小鼠抗體（HAMA）會嚴(yán)重影響檢測結(jié)果。在排除以上提到的各種因素后,由中和確認(rèn)試驗(yàn)對弱反應(yīng)性標(biāo)本進(jìn)行確認(rèn)。

未確認(rèn)的標(biāo)本得出的HBsAg 復(fù)檢反應(yīng)性結(jié)果原因有可能為非特異性反應(yīng)（假反應(yīng)性）。本研究中,HBsAg 和HBsAb 同時陽性的標(biāo)本, 確認(rèn)試驗(yàn)陽性率降低,也可能是非特異性反應(yīng)的干擾。在HBV感染的初期或者HBV 感染后的恢復(fù)期前期, 對低水平HBsAg 的檢測過程可能被血清標(biāo)本中某些非特異性結(jié)合物質(zhì)所干擾。建議綜合評估患者HBV感染的各項指標(biāo), 包括除HBsAg 外的其他血清學(xué)標(biāo)志物（例如總HBc 抗體）或者HBV DNA 等,也推薦在4～6 周后重新對HBsAg 進(jìn)行測定, 以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性[16]。

總之,本研究對CMIA 檢測HBsAg 弱反應(yīng)性血清標(biāo)本的性能進(jìn)行了探討,系統(tǒng)的分析了CMIA 檢測到的弱反應(yīng)性結(jié)果的符合率和精密度,對臨床弱反應(yīng)性結(jié)果的處理和結(jié)果審核具有一定的參考價值。