張 迪，王宏雨，林衍銓

（福建省農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所，福建 福州 350014）

廣葉繡球菌（Sparassis latifolia） 具有很高的營養(yǎng)保健價值，繡球菌中含有大量的活性多糖，能夠提高人體免疫力及機體造血能力，并能預防和抑制腫瘤[1-4]。前人的研究中提取的繡球菌活性多糖，多為采用堿溶液提取的，難溶性或不溶性多糖，其一級結(jié)構(gòu)是具有1，6分支結(jié)構(gòu)的β-1，3-葡聚糖，大約每3個主鏈單元中有1個分支[5]。

硫酸化修飾被認為是有效的多糖改性方法，硫酸化多糖也稱多糖硫酸酯，是指多糖鏈上的羥基被生物體自然生成或人工合成的硫酸基團取代，而形成的改性多糖[6]。多糖硫酸化常用的方法有wolfrom法、nagsawa法、濃硫酸法、三氧化硫-吡啶法及三氧化硫-二甲基甲酰胺法等。吡喃型多糖的硫酸酯化多采用wolfrom法，用磺酰氯與吡啶的混合物作為硫酸酯化試劑對多糖進行硫酸酯化。目前的研究結(jié)果表明[7-8]，多糖的硫酸化修飾常常能帶來部分活性功能的提升或增加，這主要緣于硫酸基團的引入導致的多糖的物理性質(zhì)和活性結(jié)構(gòu)特性的改善。

目前對繡球菌活性多糖的研究，主要集中于大分子量的難溶性β-葡聚糖，對其可溶性多糖的結(jié)構(gòu)和活性尚缺乏系統(tǒng)和深入的研究。課題組在前期研究中從繡球菌凍干品提取到一種分子量為400 KDa的可溶性多糖[9]，試驗以該水溶性多糖為研究對象，通過wolfrom法對其進行硫酸化修飾，并采用鼠脾淋巴細胞體外刺激試驗對其硫酸化修飾前后的體外免疫調(diào)節(jié)活性進行了比較分析，以期填補相關(guān)研究工作的空白，為繡球菌多糖的修飾改性研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試材料

繡球菌子實體鮮品由福建天益菌業(yè)有限公司提供。

1.2 試劑與儀器設(shè)備

細胞培養(yǎng)瓶，美國康寧公司；RPMI-1640培養(yǎng)基，美國賽默飛世爾科技公司；FBS50，美國依科賽生物科技有限公司；24孔細胞培養(yǎng)板，美國；96孔板，美國康寧股份有限公司公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純、色譜純；試驗用水為超純水。

Nicolet6700紅外光譜儀，美國賽默飛世爾科技公司；IX51倒置顯微鏡，日本奧林巴斯株式會社；超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；CO2培養(yǎng)箱，三洋電機株式會社；Centrifuge 5804-R離心機，德國艾本德股份公司；EPOCH2TC酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；真空冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；超純水器，四川優(yōu)普超純科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 繡球菌水溶性多糖的制備

以凍干繡球菌為提取原料，按參考文獻[9]所述方法，采用熱水提取法進行水溶性多糖的提取制備。

1.3.2 繡球菌水溶性多糖的DEAE Sepharose Fast Flow柱層析分離

取20 mg·mL-1的繡球菌多糖溶液10 mL上樣于DEAE Sepharose Fast Flow柱 （2.6 cm×25.0 cm） 進行分離。前15管用純水洗脫，而后用0.05 mol·L-1的NaCl溶液洗脫。流速1 mL·min-1，分部收集器收集流份5 mL/管。以無水乙醇跟蹤檢測各管中多糖，繪制多糖洗脫曲線并分別收集各流份。含鹽流份用透析袋流水透析48 h脫鹽后凍干保藏。

1.3.3 繡球菌多糖組份的硫酸化修飾

采用氯磺酸-吡啶法對繡球菌多糖進行硫酸酯化[11]。將吡啶2 mL加入接有冷凝裝置的10 mL長頸燒瓶中，將燒瓶置于冰水燒杯中預冷30 min后，在冰水浴冷卻和振蕩條件下，用移液器向燒瓶中緩慢滴加氯磺酸1.25 mL，約5 min內(nèi)滴加結(jié)束?？刂品磻w系溫度在常溫下，反應至燒瓶中出現(xiàn)大量淡黃色固體，無白煙冒出時，取出燒瓶。稱取多糖100 mg，二甲基甲酰胺用5 mL充分溶解后移入長頸燒瓶中。將燒瓶置于90℃的水浴鍋中反應3 h，其間不時振蕩搖勻。反應結(jié)束后冷卻至室溫，用10 mL冰水將反應物溶出至100 mL燒杯中，用2.5 mol·L-1的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至中性，用4倍體積無水乙醇醇沉過夜，離心收集沉淀。將沉淀溶于適量蒸餾水中，用去離子水透析72 h，透析液冷凍干燥即得到硫酸化繡球菌多糖。

1.3.4 繡球菌硫酸化多糖的硫酸基取代度測定

采用氯化鋇-明膠濁度法測定硫酸基含量[10]，并計算硫酸取代度。

1.3.5 繡球菌硫酸化多糖的紅外光譜分析

分別稱取2 mg樣品與適量的KBr粉末在白熾燈下干燥研磨均勻，壓片機壓片，紅外光譜儀在400 cm-1～4 000 cm-1區(qū)間內(nèi)掃描透射光譜進行紅外分析。

1.3.6 多糖樣品的體外鼠脾淋巴細胞刺激試驗

通過MTT法檢測水溶性多糖SCG-A、SCG-N和其硫酸化產(chǎn)物SCG-AS、SCG-NS對大鼠活體分離的第一代脾淋巴細胞體外增殖刺激活性[11]。

脾臟淋巴細胞制備：無菌操作下取出大鼠脾臟，用冷磷酸鹽緩沖液（PBS） 漂洗后將脾臟組織剪碎，冷PBS漂洗后加入0.125%胰酶+0.05%II型膠原酶進行消化；消化完成后過濾，濾液通過梯度離心收集淋巴細胞，收集的細胞經(jīng)PBS清洗后于RPMI 1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清中培養(yǎng)。

MTT法檢測細胞增殖：將脾淋巴細胞消化、調(diào)整濃度為5×104個/mL的細胞懸液備用，在96孔板中每孔加入100 μL細胞懸液；然后置于37℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)；24 h后每孔加入含各濃度多糖的培養(yǎng)基100 μL，再于37℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)72 h；然后進行MTT染色，測定490 nm的OD值，計算各組別增殖率，每個處理設(shè)3個重復，并設(shè)陰性對照組。細胞增值率（Z，%）的計算公式為：

式中：OD為處理組OD值；COD為對照組OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 繡球菌多糖的DEAE Sepharose Fast Flow柱層析分離

繡球菌多糖經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow柱層析后的洗脫曲線見圖1。

由圖1所示，根據(jù)繡球菌多糖的DEAE Sepharose Fast Flow凝膠層析洗脫曲線圖，5管～16管為不被凝膠柱吸附的穿透峰，收集該部分流份命名為SCG-N,19-24管部分為被凝膠柱吸附的NaCl溶液洗脫峰，收集該部分流份，透析脫鹽后命名為SCG-A，然后分別對其進行硫酸化修飾。

2.2 硫酸化修飾的繡球菌多糖的得率和硫酸基取代度測定

硫酸基含量標準曲線見圖2。

由圖2所示，以硫酸鉀為硫酸基取代度測定的硫酸基標樣，測定硫酸基含量標準曲線，線性回歸方程計算公式為：

式中：Y為溶液中硫酸基濃度（mg·mL-1）；X為360 nm波長下的吸光度。R2=0.998，線性擬合良好。硫酸基取代度（DS）計算公式為：

式中：S（%） 為硫酸基的含量（%）[10]。

計算結(jié)果見表1。

表1 繡球菌多糖的硫酸化修飾的產(chǎn)率及其硫酸基取代度Tab.1 The yield of sulfated modification of polysaccharide and its degree of substitution

由表1可知，通過硫酸基取代度測定發(fā)現(xiàn)，中性糖SCG-N硫酸化修飾后的硫酸基含量和取代度都顯著高于酸性糖SCG-A。

2.3 繡球菌硫酸化多糖的紅外光譜分析

SCG-A及其硫酸化衍生物SCG-AS的FT-IR圖譜見圖3。

由圖3可知，SCG-A的吸收譜帶在3 397.09 cm-1處有強且寬的吸收峰，系由多糖上的羥基產(chǎn)生；2 927.73 cm-1附近的肩峰為飽和C-H伸縮振動的信號，中等強度；1 647.47 cm-1處為酰胺羰基特征吸收峰，可見樣品中可能有一定量的糖結(jié)合蛋白；1 154.86 cm-1、1 080.86 cm-1、1 023.46 cm-13 個峰為吡喃糖環(huán)特征吸收峰，光譜在890 cm-1附近無吸收峰，而在850 cm-1有一吸收峰表明其糖苷鍵構(gòu)型主要為α型。從硫酸化樣品SCG-AS的紅外圖譜可以看出，在1 235.84 cm-1處有一強的吸收峰，為S=O的伸縮振動峰，證明其已被成功硫酸化修飾。

SCG-N及其硫酸化衍生物SCGNS的FT-IR圖譜見圖4。

由圖4可知，SCG-N的紅外光譜由于多糖中羥基的伸縮振動在3 300 cm-1處有強吸收，2 926 cm-1處的吸收歸因于C-H鍵的伸縮振動，1 000 cm-1～1 100 cm-1間為吡喃糖環(huán)的特征峰，890 cm-1與850 cm-1附近均有吸收峰，可見其中既含有β型吡喃糖苷鍵也含有α型吡喃糖苷鍵。SCG-NS的紅外光譜在1 243.60 cm-1處出現(xiàn)了一個強吸收峰，該峰為S=O的伸縮振動峰，表明SCG-N已被成功地硫酸化修飾。

2.4 繡球菌多糖硫酸化修飾前后對鼠脾淋巴細胞體外刺激活性

經(jīng)MTT法72 h處理的SCG-A和SCG-AS對大鼠脾淋巴細胞增殖率的影響見圖5。

由圖5、圖6可知，硫酸化修飾后的SCG-AS和SCG-NS在低濃度處理下，二者促進增殖的刺激活性都有顯著的提高，SCG-N硫酸化修飾后對其活性的提升較SCG-A顯著，SCG-N原在50 μg·mL-1濃度下檢測不到刺激活性，但經(jīng)硫酸化修飾后其硫酸化產(chǎn)物SCG-NS細胞增殖率提高為50.22%，表現(xiàn)出很強的刺激活性。但在高濃度處理組，硫酸化修飾多糖SCG-AS（>200 μg·mL-1）、SCG-NS（>400 μg·mL-1）促進增殖的刺激活性并未繼續(xù)提高，反而出現(xiàn)了下降。

3 結(jié)果與討論

目前對繡球菌多糖的研究主要以其β-葡聚糖為研究對象，對其可溶性多糖的研究鮮有報道。試驗以前期從凍干品繡球菌中提取分子量約400 KDa的可溶性多糖為研究對象[9]，經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow柱分離得到SCG-A和SCG-N多糖組份，經(jīng)紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)SCG-A為α型酸性多糖，而中性糖組份SCG-N同時含有α、β多糖，由此可見繡球菌可溶性糖主要以α型多糖構(gòu)成。通過硫酸基取代度測定發(fā)現(xiàn)中性糖SCG-N硫酸化修飾后的硫酸基含量和取代度都顯著高于酸性糖SCG-A，這可能與其糖鏈中可供酯化的羥基數(shù)量更多有關(guān)。

通過大鼠脾淋巴細胞體外刺激活性測試比較了水溶性多糖SCG-A、SCG-N與其硫酸化產(chǎn)物SCGAS、SCG-NS的體外免疫活性差異。檢測結(jié)果顯示，未硫酸化前SCG-A、SCG-N均具有不同程度的促進脾淋巴細胞增殖的活性，SCG-A對大鼠脾淋巴細胞的刺激作用較好，在最低濃度50 μg·mL-1下仍可以觀察到明顯的促進作用，增殖率為21.78%，且在50 μg·mL-1～800 μg·mL-1的范圍內(nèi)存在明顯劑量依賴關(guān)系；相比之下SCG-N的活性較差，在50 μg·mL-1低濃度處理時基本觀察不到促進效果。硫酸化修飾后，在低濃度處理時，SCG-AS、SCG-NS對大鼠脾淋巴細胞的體外促進增殖的刺激活性都有了顯著的提高，SCG-NS的提升幅度要強于SCG-AS，提升的幅度可能與硫酸化產(chǎn)物的硫酸基取代度有一定的關(guān)系，同時高濃度處理組刺激活性的下降，也可能與高濃度的硫酸基團的抑制或毒性作用有關(guān)，這些都有待進一步研究。