侯冬冬，劉朋，趙祥忠，姚艷艷，何熹*

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353；2.國家海產(chǎn)貝類工程技術(shù)研究中心，山東 威海 264316）

葡萄酒的釀造是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及不同微生物的相互作用，其中主要包括釀酒酵母和乳酸菌。釀酒酵母主要負(fù)責(zé)酒精發(fā)酵，可以將葡萄汁中的糖轉(zhuǎn)化為酒精和CO2，是葡萄酒香氣物質(zhì)形成的主要時(shí)期[1]。蘋果酸-乳酸發(fā)酵通常在酒精發(fā)酵期間或酒精發(fā)酵結(jié)束時(shí)進(jìn)行，由一種或多種乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）啟動并進(jìn)行[2]。其能夠降低葡萄酒的酸度，并且有利于提高微生物的穩(wěn)定，乳酸菌的次級代謝產(chǎn)物還能夠極大地豐富葡萄酒的香氣，提高感官特性[3-4]。在所有乳酸菌品種中，酒酒球菌既能適應(yīng)惡劣的葡萄酒環(huán)境，又能通過蘋果酸-乳酸發(fā)酵改善葡萄酒口感，因此是商業(yè)葡萄酒發(fā)酵劑的代表菌株。

由于酒酒球菌在葡萄酒釀造中的重要地位，越來越多的研究者對酒酒球菌做了相關(guān)研究。在研究初期，通過對我國葡萄酒主產(chǎn)區(qū)的乳酸菌進(jìn)行分離和鑒定，從中篩選出了釀酒適應(yīng)性和釀酒特性優(yōu)良的菌株[5]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，酒酒球菌能夠在復(fù)雜的葡萄酒環(huán)境中生存，其產(chǎn)生的次級代謝物能夠提高葡萄酒的品質(zhì)和改善風(fēng)味[6]。雖然酒酒球菌能夠耐受環(huán)境中葡萄酒發(fā)酵中的乙醇、SO2等不利條件，但是葡萄酒中存在的各種因素，都有可能制約著酒酒球菌的生長繁殖和代謝[7]。全面認(rèn)識酒酒球菌在葡萄酒釀造中的作用有利于更好地調(diào)控葡萄酒蘋乳發(fā)酵，從而進(jìn)一步提高其在葡萄酒釀造中的應(yīng)用。

1 酒酒球菌的分離篩選和鑒定

在葡萄酒釀造中啟動并參與蘋果酸-乳酸發(fā)酵（簡稱蘋乳發(fā)酵）的乳酸菌被稱為葡萄酒乳酸菌，目前研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)主要有4個(gè)屬，分別為乳桿菌屬（Lactobacillus beijerinck）、明串珠球菌屬（Leuconostoe mesenteroides）、片球菌屬（Pediococcus blaussen）以及酒球菌屬（Oenococcus）[5]。在所有的蘋乳發(fā)酵菌株中，酒酒球菌表現(xiàn)出優(yōu)良的釀酒風(fēng)味特性，對提升葡萄酒品質(zhì)有著積極作用，因此商業(yè)乳酸菌主要以酒酒球菌為主導(dǎo)者。植物乳桿菌也是發(fā)酵過程中一種常見的菌種，可以作為蘋乳發(fā)酵的啟動菌。有相關(guān)研究表明植物乳桿菌會在蘋乳發(fā)酵過程中產(chǎn)生生物胺等不良次級代謝物，使酒產(chǎn)生鼠臭味影響葡萄酒的品質(zhì)和香氣[8]。因此，分離篩選和鑒定出具有優(yōu)良釀酒適應(yīng)性和釀酒特性的酒酒球菌，對于提高葡萄酒二次發(fā)酵品質(zhì)具有重大意義。

1.1 酒酒球菌的分離篩選

酒酒球菌是一種營養(yǎng)缺陷型菌株，絕大多數(shù)菌株缺乏煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，需要在添加番茄汁生長因子的培養(yǎng)基中才能夠生長[5]。目前我們所采用的酒酒球菌分離培養(yǎng)基為番茄汁培養(yǎng)基。為了提高酒酒球菌的鑒別能力，一般還會添加放線菌酮50 mg/L、萬古霉素50 mg/L（放線菌酮能有效地抑制酵母菌和霉菌的生長，萬古霉素能夠抑制其他乳酸菌）。通過添加這兩種抗生素，可以分離得到原存在于葡萄酒中的酒酒球菌[9-10]。

1.2 酒酒球菌的鑒定

對分離得到的酒酒球菌一般會先采用生化鑒定，主要從菌株的形態(tài)特征（細(xì)胞球型至橢圓型，常成對和鏈形排列，直徑通常小于1 μm）、生理生化特征（革蘭氏陽性菌，能夠分解蘋果酸）等方面進(jìn)行分類區(qū)別[11]。生化鑒定法作為一種基礎(chǔ)鑒定方法，雖然操作簡單，但過程會相對復(fù)雜，耗時(shí)長，結(jié)果也會有差異性。隨著科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，分子技術(shù)不斷推陳出新，特別是在物種鑒定方面，逐漸形成快速準(zhǔn)確的方法。目前的分子鑒定方法一般為16SrRNA、分子標(biāo)記、擴(kuò)增核糖體DNA限制性分析和多位點(diǎn)序列分析[12]。我國葡萄種植和葡萄酒釀造地域性差距大，分離篩選和鑒定出本土優(yōu)質(zhì)的酒酒球菌菌種，對我國葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有推動作用。

2 酒酒球菌對葡萄酒釀造的作用

酒酒球菌是目前公認(rèn)的能夠較快適應(yīng)葡萄酒酒精發(fā)酵之后惡劣環(huán)境的一類乳酸菌，如低pH值、高SO2濃度和高乙醇體積分?jǐn)?shù)[13]，能夠?qū)ζ咸丫铺O乳發(fā)酵起到啟動和執(zhí)行的作用。蘋乳發(fā)酵主要指葡萄酒中蘋果酸通過酒酒球菌作用轉(zhuǎn)化為乳酸的過程。在此過程中能夠提高葡萄酒pH值，一般被認(rèn)為是葡萄酒的生物降酸過程[14]。此外，酒酒球菌在發(fā)酵過程中還會產(chǎn)生許多次級代謝物，一部分為自身的生長和繁殖提供能量和營養(yǎng)，另一部分能在一定程度上賦予葡萄酒豐富的香氣[5]。此過程對于提高葡萄酒品質(zhì)的意義在于提高葡萄酒生物穩(wěn)定性、降低色度、增加香氣復(fù)雜度、提高葡萄酒品質(zhì)和改善口感[15]。

2.1 提高葡萄酒生物穩(wěn)定性

葡萄酒是葡萄汁經(jīng)過發(fā)酵形成的產(chǎn)物。酵母通過酒精發(fā)酵將絕大多數(shù)的營養(yǎng)物質(zhì)消耗掉，這一過程會產(chǎn)生大量有機(jī)酸，其中蘋果酸容易被多種微生物利用，因而會使葡萄酒在貯存過程中腐敗。在蘋乳發(fā)酵過程中，酒酒球菌對蘋果酸具有獨(dú)特的分解作用，同時(shí)也會消耗其他營養(yǎng)物質(zhì)，從而減少其他有害微生物的產(chǎn)生，經(jīng)過這一過程，可以提高葡萄酒生物穩(wěn)定性，有益于延長葡萄酒貯存時(shí)間[16]。

2.2 降低葡萄酒色度

葡萄酒的顏色是判斷葡萄酒品質(zhì)的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)，其顏色的形成主要與葡萄品種和陳釀有關(guān)，主要成分為花色苷。參與蘋乳發(fā)酵的酒酒球菌可以利用與SO2結(jié)合的物質(zhì)如α-酮戊二酸、丙酮酸等，可以釋放出SO2[17]。處于游離狀態(tài)的SO2可以與花色苷結(jié)合，從而減少葡萄酒中的顯色物質(zhì)[18]，經(jīng)過這一過程可以使葡萄酒的顏色更加具有觀賞性。

2.3 增加葡萄酒香氣復(fù)雜度

隨著葡萄酒酸度的降低，會使酒的口味變得柔和圓潤。酒酒球菌在將蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸的同時(shí)也會產(chǎn)生一些次級代謝物，比如雙乙酰、乙偶姻、2，3-丁二醇及其它優(yōu)良的風(fēng)味物質(zhì)，這些都是對葡萄酒有利的物質(zhì)，能夠增加葡萄酒香氣的豐滿性和復(fù)雜度[19]。

2.4 提高葡萄酒品質(zhì)改善口感

酸類物質(zhì)是葡萄酒的主要成分，其組成和含量直接和間接影響著葡萄酒的品質(zhì)[20]。葡萄酒中的有機(jī)酸主要是蘋果酸和酒石酸，其中蘋果酸給人的感官特征為尖銳且?guī)в袧?，不太容易被人接受[21]。經(jīng)過酒酒球菌轉(zhuǎn)化為乳酸，乳酸口感柔和順口，沒有澀感[22]。因此，能夠在提高葡萄酒品質(zhì)的同時(shí)改善口感，讓更多的人群接受。這使得酒酒球菌在葡萄酒后期香氣形成中有著獨(dú)特的作用。

2.5 酒酒球菌可能引起的潛在質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)

相關(guān)研究表明，當(dāng)葡萄酒蘋乳發(fā)酵結(jié)束后不立即采取中止措施，酒酒球菌可會轉(zhuǎn)化為病原菌，引發(fā)葡萄酒病害，如酒石酸發(fā)酵病、乳酸發(fā)酵病、乳酸性酸敗等[23]。因此在進(jìn)行蘋乳發(fā)酵時(shí)，檢測蘋果酸和乳酸的含量是十分有必要的，嚴(yán)格的工藝流程也是生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)葡萄酒的先決條件。

3 葡萄酒釀造過程對酒酒球菌的影響

酒酒球菌獨(dú)特的釀酒特性會影響其生長的環(huán)境，即對葡萄酒品質(zhì)的影響[12]。而在這一過程中，葡萄酒的自身環(huán)境同樣是制約著酒酒球菌的生長的關(guān)鍵因素。除此之外，不同的釀酒工藝，如酒酒球菌不同的接種量和接種時(shí)間也會影響其生長。酒精發(fā)酵后殘留的酵母菌，以及其他乳酸菌菌群，彼此之間的相互作用同樣會對酒酒球菌有影響[24]。

3.1 環(huán)境因素對酒酒球菌的影響

酒精發(fā)酵結(jié)束后，葡萄酒處于比較惡劣的環(huán)境：低pH值、高酒精度、高SO2濃度等，這些因素很大程度上影響了酒酒球菌的生存和生長[25-26]。pH值越低，對酒酒球菌的抑制效果越明顯，會阻礙蘋乳發(fā)酵的啟動。酒精是酒酒球菌在葡萄酒中生長的主要抑制因子，高含量乙醇能影響細(xì)胞膜流動性，會阻礙酒酒球菌生長[27]。溶解氧不僅不利于酒酒球菌生長，還會使醋酸菌等有害微生物大量繁殖，乙酸、雙乙酰等不良產(chǎn)物含量上升，使葡萄酒敗壞[28]。SO2在葡萄酒釀造過程中起到抗氧化、抑制野生酵母和腐敗菌生長的作用，但它對酒酒球菌也會有一定的抑制作用，當(dāng)濃度大于100 mg/L時(shí)，酒酒球菌將會完全被抑制，無法生長[29]。研究表明：酒酒球菌能夠在pH值不低于3.2、酒精度10%vol～14%vol、總SO2濃度不超過50 mg/L條件下正常生長[26]。

3.2 不同接種量和接種時(shí)間的影響

酒酒球菌不同的接種量會影響蘋乳發(fā)酵的速度，從而影響葡萄酒中揮發(fā)酸的含量和葡萄酒的色澤。不同的酒酒球菌發(fā)酵特性不同，在使用前應(yīng)進(jìn)行接種量試驗(yàn)，選擇最佳接種量有利于蘋乳發(fā)酵的順利進(jìn)行[30]。同時(shí)接種時(shí)間對蘋乳發(fā)酵的啟動和保持菌種活性同樣重要。通常有以下3種接種時(shí)間安排：混合接種（在酒精發(fā)酵啟動時(shí)與酵母同時(shí)接種），過程接種（在酒精發(fā)酵過程中接種），順序接種（酒精發(fā)酵結(jié)束后接種），接種時(shí)間會影響接種后酒酒球菌的成活率和延滯期的長短[31]?；旌辖臃N和過程接種會在一定程度上影響酒精發(fā)酵，對于葡萄酒香氣物質(zhì)的形成存在不可控性。因此，目前在葡萄酒釀造中都是采用順序接種。

3.3 微生物間相互作用

酵母菌和酒酒球菌有一定的抑制作用。首先，酒酒球菌能產(chǎn)生分解酵母菌細(xì)胞壁的β-1，3葡聚糖酶[32]；其次，酵母菌會產(chǎn)生抑制肽、酒精和中鏈脂肪酸，它們在一定的濃度下也會抑制酒酒球菌的生長[33]。葡萄酒在酒精發(fā)酵結(jié)束后，存在一些酵母沒有利用完的營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)酵母菌自溶會釋放蛋白質(zhì)等大分子化合物[34]。此時(shí)，葡萄酒中存在的乳酸菌群體就會相互競爭這些營養(yǎng)物質(zhì)，其中植物乳桿菌和戊糖片球菌會產(chǎn)生一些短肽和蛋白質(zhì)，會對酒酒球菌有強(qiáng)烈的抑制作用，雖然會造成酒酒球菌生長速率降低，但是對其并沒有致死作用[35]。希氏乳桿菌也會和酒酒球菌競爭氮源和多肽，會產(chǎn)生一種互害共棲的關(guān)系[36]。在葡萄酒釀造時(shí)，可以通過人工添加酒酒球菌的方式，有利于蘋乳發(fā)酵的進(jìn)行。

4 酒酒球菌分子生物學(xué)研究

分子生物學(xué)是從分子水平上闡明遺傳、生殖、生長和發(fā)育等生命特征的分子機(jī)理，從而為利用和改造生物奠定理論基礎(chǔ)和提供新手段。長期以來，人們利用這一技術(shù)對酒酒球菌也進(jìn)行了深入研究，現(xiàn)階段對其的研究主要集中在以下幾個(gè)方面：種類鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、全基因組測序、種群遺傳學(xué)、抗脅迫性分子機(jī)理及調(diào)控等[37-38]。

通過酒酒球菌完整基因組序列，可以預(yù)測其生理學(xué)特性，并且驗(yàn)證相關(guān)基因在釀酒中的功能。其中蘋乳發(fā)酵啟動的相關(guān)基因mleA（蘋果酸乳酸酶基因）及mleP（蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因）研究比較多，一般都會將這兩個(gè)基因外源表達(dá)在酵母中，雖然這樣能夠使酵母同時(shí)具備啟動蘋乳發(fā)酵載體的功能，但蘋乳發(fā)酵還會涉及其他物質(zhì)的代謝，是酵母無法替代的[39-40]。因此，如果利用分子生物學(xué)技術(shù)對酒酒球菌進(jìn)行改造，有利于更高效的進(jìn)行蘋乳發(fā)酵啟動，同時(shí)酒酒球菌本身也會賦予葡萄酒更加豐富的香氣成分。可是目前由于酒酒球菌具有生長緩慢，不易培養(yǎng)等特點(diǎn)，同時(shí)又缺乏相關(guān)的載體，因此對其進(jìn)行轉(zhuǎn)化存在相當(dāng)大的困難。

5 結(jié)語

酒酒球菌作為葡萄酒蘋乳發(fā)酵的啟動者和執(zhí)行者，優(yōu)良菌株的篩選及其釀酒特性一直是人們的研究重點(diǎn)。優(yōu)良酒酒球菌能夠代謝蘋果酸、糖、含氮物質(zhì)等，產(chǎn)生的次級代謝物能夠豐富葡萄酒風(fēng)味，提高葡萄酒感官品評。酒酒球菌在復(fù)雜的葡萄酒環(huán)境中，每一個(gè)因素都能影響其生長繁殖和代謝，各個(gè)因素作用機(jī)制尚不明確，這些因素對酒酒球菌的作用機(jī)理還有待研究。酒酒球菌工程菌株構(gòu)建一直還未明了，如果將有利于葡萄酒香氣的相關(guān)基因表達(dá)到酒酒球菌中，能夠在葡萄酒發(fā)酵的最后階段對其香氣的形成有很好的塑造作用。因此，未來對酒酒球菌的作用機(jī)理研究和工程菌株的構(gòu)建將是其研究重點(diǎn)。