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        酒酒球菌在葡萄酒中的應(yīng)用研究進(jìn)展

        2021-01-17 18:22:49侯冬冬劉朋趙祥忠姚艷艷何熹
        食品研究與開發(fā) 2021年24期
        關(guān)鍵詞:蘋果酸釀造球菌

        侯冬冬,劉朋,趙祥忠,姚艷艷,何熹*

        (1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)生物工程學(xué)院,山東 濟(jì)南 250353;2.國(guó)家海產(chǎn)貝類工程技術(shù)研究中心,山東 威海 264316)

        葡萄酒的釀造是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,涉及不同微生物的相互作用,其中主要包括釀酒酵母和乳酸菌。釀酒酵母主要負(fù)責(zé)酒精發(fā)酵,可以將葡萄汁中的糖轉(zhuǎn)化為酒精和CO2,是葡萄酒香氣物質(zhì)形成的主要時(shí)期[1]。蘋果酸-乳酸發(fā)酵通常在酒精發(fā)酵期間或酒精發(fā)酵結(jié)束時(shí)進(jìn)行,由一種或多種乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)啟動(dòng)并進(jìn)行[2]。其能夠降低葡萄酒的酸度,并且有利于提高微生物的穩(wěn)定,乳酸菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物還能夠極大地豐富葡萄酒的香氣,提高感官特性[3-4]。在所有乳酸菌品種中,酒酒球菌既能適應(yīng)惡劣的葡萄酒環(huán)境,又能通過(guò)蘋果酸-乳酸發(fā)酵改善葡萄酒口感,因此是商業(yè)葡萄酒發(fā)酵劑的代表菌株。

        由于酒酒球菌在葡萄酒釀造中的重要地位,越來(lái)越多的研究者對(duì)酒酒球菌做了相關(guān)研究。在研究初期,通過(guò)對(duì)我國(guó)葡萄酒主產(chǎn)區(qū)的乳酸菌進(jìn)行分離和鑒定,從中篩選出了釀酒適應(yīng)性和釀酒特性優(yōu)良的菌株[5]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),酒酒球菌能夠在復(fù)雜的葡萄酒環(huán)境中生存,其產(chǎn)生的次級(jí)代謝物能夠提高葡萄酒的品質(zhì)和改善風(fēng)味[6]。雖然酒酒球菌能夠耐受環(huán)境中葡萄酒發(fā)酵中的乙醇、SO2等不利條件,但是葡萄酒中存在的各種因素,都有可能制約著酒酒球菌的生長(zhǎng)繁殖和代謝[7]。全面認(rèn)識(shí)酒酒球菌在葡萄酒釀造中的作用有利于更好地調(diào)控葡萄酒蘋乳發(fā)酵,從而進(jìn)一步提高其在葡萄酒釀造中的應(yīng)用。

        1 酒酒球菌的分離篩選和鑒定

        在葡萄酒釀造中啟動(dòng)并參與蘋果酸-乳酸發(fā)酵(簡(jiǎn)稱蘋乳發(fā)酵)的乳酸菌被稱為葡萄酒乳酸菌,目前研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)主要有4個(gè)屬,分別為乳桿菌屬(Lactobacillus beijerinck)、明串珠球菌屬(Leuconostoe mesenteroides)、片球菌屬(Pediococcus blaussen)以及酒球菌屬(Oenococcus)[5]。在所有的蘋乳發(fā)酵菌株中,酒酒球菌表現(xiàn)出優(yōu)良的釀酒風(fēng)味特性,對(duì)提升葡萄酒品質(zhì)有著積極作用,因此商業(yè)乳酸菌主要以酒酒球菌為主導(dǎo)者。植物乳桿菌也是發(fā)酵過(guò)程中一種常見的菌種,可以作為蘋乳發(fā)酵的啟動(dòng)菌。有相關(guān)研究表明植物乳桿菌會(huì)在蘋乳發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生生物胺等不良次級(jí)代謝物,使酒產(chǎn)生鼠臭味影響葡萄酒的品質(zhì)和香氣[8]。因此,分離篩選和鑒定出具有優(yōu)良釀酒適應(yīng)性和釀酒特性的酒酒球菌,對(duì)于提高葡萄酒二次發(fā)酵品質(zhì)具有重大意義。

        1.1 酒酒球菌的分離篩選

        酒酒球菌是一種營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株,絕大多數(shù)菌株缺乏煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-葡萄糖-6-磷酸脫氫酶,需要在添加番茄汁生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基中才能夠生長(zhǎng)[5]。目前我們所采用的酒酒球菌分離培養(yǎng)基為番茄汁培養(yǎng)基。為了提高酒酒球菌的鑒別能力,一般還會(huì)添加放線菌酮50 mg/L、萬(wàn)古霉素50 mg/L(放線菌酮能有效地抑制酵母菌和霉菌的生長(zhǎng),萬(wàn)古霉素能夠抑制其他乳酸菌)。通過(guò)添加這兩種抗生素,可以分離得到原存在于葡萄酒中的酒酒球菌[9-10]。

        1.2 酒酒球菌的鑒定

        對(duì)分離得到的酒酒球菌一般會(huì)先采用生化鑒定,主要從菌株的形態(tài)特征(細(xì)胞球型至橢圓型,常成對(duì)和鏈形排列,直徑通常小于1 μm)、生理生化特征(革蘭氏陽(yáng)性菌,能夠分解蘋果酸)等方面進(jìn)行分類區(qū)別[11]。生化鑒定法作為一種基礎(chǔ)鑒定方法,雖然操作簡(jiǎn)單,但過(guò)程會(huì)相對(duì)復(fù)雜,耗時(shí)長(zhǎng),結(jié)果也會(huì)有差異性。隨著科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展,分子技術(shù)不斷推陳出新,特別是在物種鑒定方面,逐漸形成快速準(zhǔn)確的方法。目前的分子鑒定方法一般為16SrRNA、分子標(biāo)記、擴(kuò)增核糖體DNA限制性分析和多位點(diǎn)序列分析[12]。我國(guó)葡萄種植和葡萄酒釀造地域性差距大,分離篩選和鑒定出本土優(yōu)質(zhì)的酒酒球菌菌種,對(duì)我國(guó)葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有推動(dòng)作用。

        2 酒酒球菌對(duì)葡萄酒釀造的作用

        酒酒球菌是目前公認(rèn)的能夠較快適應(yīng)葡萄酒酒精發(fā)酵之后惡劣環(huán)境的一類乳酸菌,如低pH值、高SO2濃度和高乙醇體積分?jǐn)?shù)[13],能夠?qū)ζ咸丫铺O乳發(fā)酵起到啟動(dòng)和執(zhí)行的作用。蘋乳發(fā)酵主要指葡萄酒中蘋果酸通過(guò)酒酒球菌作用轉(zhuǎn)化為乳酸的過(guò)程。在此過(guò)程中能夠提高葡萄酒pH值,一般被認(rèn)為是葡萄酒的生物降酸過(guò)程[14]。此外,酒酒球菌在發(fā)酵過(guò)程中還會(huì)產(chǎn)生許多次級(jí)代謝物,一部分為自身的生長(zhǎng)和繁殖提供能量和營(yíng)養(yǎng),另一部分能在一定程度上賦予葡萄酒豐富的香氣[5]。此過(guò)程對(duì)于提高葡萄酒品質(zhì)的意義在于提高葡萄酒生物穩(wěn)定性、降低色度、增加香氣復(fù)雜度、提高葡萄酒品質(zhì)和改善口感[15]。

        2.1 提高葡萄酒生物穩(wěn)定性

        葡萄酒是葡萄汁經(jīng)過(guò)發(fā)酵形成的產(chǎn)物。酵母通過(guò)酒精發(fā)酵將絕大多數(shù)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗掉,這一過(guò)程會(huì)產(chǎn)生大量有機(jī)酸,其中蘋果酸容易被多種微生物利用,因而會(huì)使葡萄酒在貯存過(guò)程中腐敗。在蘋乳發(fā)酵過(guò)程中,酒酒球菌對(duì)蘋果酸具有獨(dú)特的分解作用,同時(shí)也會(huì)消耗其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),從而減少其他有害微生物的產(chǎn)生,經(jīng)過(guò)這一過(guò)程,可以提高葡萄酒生物穩(wěn)定性,有益于延長(zhǎng)葡萄酒貯存時(shí)間[16]。

        2.2 降低葡萄酒色度

        葡萄酒的顏色是判斷葡萄酒品質(zhì)的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn),其顏色的形成主要與葡萄品種和陳釀?dòng)嘘P(guān),主要成分為花色苷。參與蘋乳發(fā)酵的酒酒球菌可以利用與SO2結(jié)合的物質(zhì)如α-酮戊二酸、丙酮酸等,可以釋放出SO2[17]。處于游離狀態(tài)的SO2可以與花色苷結(jié)合,從而減少葡萄酒中的顯色物質(zhì)[18],經(jīng)過(guò)這一過(guò)程可以使葡萄酒的顏色更加具有觀賞性。

        2.3 增加葡萄酒香氣復(fù)雜度

        隨著葡萄酒酸度的降低,會(huì)使酒的口味變得柔和圓潤(rùn)。酒酒球菌在將蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸的同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生一些次級(jí)代謝物,比如雙乙酰、乙偶姻、2,3-丁二醇及其它優(yōu)良的風(fēng)味物質(zhì),這些都是對(duì)葡萄酒有利的物質(zhì),能夠增加葡萄酒香氣的豐滿性和復(fù)雜度[19]。

        2.4 提高葡萄酒品質(zhì)改善口感

        酸類物質(zhì)是葡萄酒的主要成分,其組成和含量直接和間接影響著葡萄酒的品質(zhì)[20]。葡萄酒中的有機(jī)酸主要是蘋果酸和酒石酸,其中蘋果酸給人的感官特征為尖銳且?guī)в袧校惶菀妆蝗私邮躘21]。經(jīng)過(guò)酒酒球菌轉(zhuǎn)化為乳酸,乳酸口感柔和順口,沒(méi)有澀感[22]。因此,能夠在提高葡萄酒品質(zhì)的同時(shí)改善口感,讓更多的人群接受。這使得酒酒球菌在葡萄酒后期香氣形成中有著獨(dú)特的作用。

        2.5 酒酒球菌可能引起的潛在質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)

        相關(guān)研究表明,當(dāng)葡萄酒蘋乳發(fā)酵結(jié)束后不立即采取中止措施,酒酒球菌可會(huì)轉(zhuǎn)化為病原菌,引發(fā)葡萄酒病害,如酒石酸發(fā)酵病、乳酸發(fā)酵病、乳酸性酸敗等[23]。因此在進(jìn)行蘋乳發(fā)酵時(shí),檢測(cè)蘋果酸和乳酸的含量是十分有必要的,嚴(yán)格的工藝流程也是生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)葡萄酒的先決條件。

        3 葡萄酒釀造過(guò)程對(duì)酒酒球菌的影響

        酒酒球菌獨(dú)特的釀酒特性會(huì)影響其生長(zhǎng)的環(huán)境,即對(duì)葡萄酒品質(zhì)的影響[12]。而在這一過(guò)程中,葡萄酒的自身環(huán)境同樣是制約著酒酒球菌的生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素。除此之外,不同的釀酒工藝,如酒酒球菌不同的接種量和接種時(shí)間也會(huì)影響其生長(zhǎng)。酒精發(fā)酵后殘留的酵母菌,以及其他乳酸菌菌群,彼此之間的相互作用同樣會(huì)對(duì)酒酒球菌有影響[24]。

        3.1 環(huán)境因素對(duì)酒酒球菌的影響

        酒精發(fā)酵結(jié)束后,葡萄酒處于比較惡劣的環(huán)境:低pH值、高酒精度、高SO2濃度等,這些因素很大程度上影響了酒酒球菌的生存和生長(zhǎng)[25-26]。pH值越低,對(duì)酒酒球菌的抑制效果越明顯,會(huì)阻礙蘋乳發(fā)酵的啟動(dòng)。酒精是酒酒球菌在葡萄酒中生長(zhǎng)的主要抑制因子,高含量乙醇能影響細(xì)胞膜流動(dòng)性,會(huì)阻礙酒酒球菌生長(zhǎng)[27]。溶解氧不僅不利于酒酒球菌生長(zhǎng),還會(huì)使醋酸菌等有害微生物大量繁殖,乙酸、雙乙酰等不良產(chǎn)物含量上升,使葡萄酒敗壞[28]。SO2在葡萄酒釀造過(guò)程中起到抗氧化、抑制野生酵母和腐敗菌生長(zhǎng)的作用,但它對(duì)酒酒球菌也會(huì)有一定的抑制作用,當(dāng)濃度大于100 mg/L時(shí),酒酒球菌將會(huì)完全被抑制,無(wú)法生長(zhǎng)[29]。研究表明:酒酒球菌能夠在pH值不低于3.2、酒精度10%vol~14%vol、總SO2濃度不超過(guò)50 mg/L條件下正常生長(zhǎng)[26]。

        3.2 不同接種量和接種時(shí)間的影響

        酒酒球菌不同的接種量會(huì)影響蘋乳發(fā)酵的速度,從而影響葡萄酒中揮發(fā)酸的含量和葡萄酒的色澤。不同的酒酒球菌發(fā)酵特性不同,在使用前應(yīng)進(jìn)行接種量試驗(yàn),選擇最佳接種量有利于蘋乳發(fā)酵的順利進(jìn)行[30]。同時(shí)接種時(shí)間對(duì)蘋乳發(fā)酵的啟動(dòng)和保持菌種活性同樣重要。通常有以下3種接種時(shí)間安排:混合接種(在酒精發(fā)酵啟動(dòng)時(shí)與酵母同時(shí)接種),過(guò)程接種(在酒精發(fā)酵過(guò)程中接種),順序接種(酒精發(fā)酵結(jié)束后接種),接種時(shí)間會(huì)影響接種后酒酒球菌的成活率和延滯期的長(zhǎng)短[31]。混合接種和過(guò)程接種會(huì)在一定程度上影響酒精發(fā)酵,對(duì)于葡萄酒香氣物質(zhì)的形成存在不可控性。因此,目前在葡萄酒釀造中都是采用順序接種。

        3.3 微生物間相互作用

        酵母菌和酒酒球菌有一定的抑制作用。首先,酒酒球菌能產(chǎn)生分解酵母菌細(xì)胞壁的β-1,3葡聚糖酶[32];其次,酵母菌會(huì)產(chǎn)生抑制肽、酒精和中鏈脂肪酸,它們?cè)谝欢ǖ臐舛认乱矔?huì)抑制酒酒球菌的生長(zhǎng)[33]。葡萄酒在酒精發(fā)酵結(jié)束后,存在一些酵母沒(méi)有利用完的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),同時(shí)酵母菌自溶會(huì)釋放蛋白質(zhì)等大分子化合物[34]。此時(shí),葡萄酒中存在的乳酸菌群體就會(huì)相互競(jìng)爭(zhēng)這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),其中植物乳桿菌和戊糖片球菌會(huì)產(chǎn)生一些短肽和蛋白質(zhì),會(huì)對(duì)酒酒球菌有強(qiáng)烈的抑制作用,雖然會(huì)造成酒酒球菌生長(zhǎng)速率降低,但是對(duì)其并沒(méi)有致死作用[35]。希氏乳桿菌也會(huì)和酒酒球菌競(jìng)爭(zhēng)氮源和多肽,會(huì)產(chǎn)生一種互害共棲的關(guān)系[36]。在葡萄酒釀造時(shí),可以通過(guò)人工添加酒酒球菌的方式,有利于蘋乳發(fā)酵的進(jìn)行。

        4 酒酒球菌分子生物學(xué)研究

        分子生物學(xué)是從分子水平上闡明遺傳、生殖、生長(zhǎng)和發(fā)育等生命特征的分子機(jī)理,從而為利用和改造生物奠定理論基礎(chǔ)和提供新手段。長(zhǎng)期以來(lái),人們利用這一技術(shù)對(duì)酒酒球菌也進(jìn)行了深入研究,現(xiàn)階段對(duì)其的研究主要集中在以下幾個(gè)方面:種類鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、全基因組測(cè)序、種群遺傳學(xué)、抗脅迫性分子機(jī)理及調(diào)控等[37-38]。

        通過(guò)酒酒球菌完整基因組序列,可以預(yù)測(cè)其生理學(xué)特性,并且驗(yàn)證相關(guān)基因在釀酒中的功能。其中蘋乳發(fā)酵啟動(dòng)的相關(guān)基因mleA(蘋果酸乳酸酶基因)及mleP(蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因)研究比較多,一般都會(huì)將這兩個(gè)基因外源表達(dá)在酵母中,雖然這樣能夠使酵母同時(shí)具備啟動(dòng)蘋乳發(fā)酵載體的功能,但蘋乳發(fā)酵還會(huì)涉及其他物質(zhì)的代謝,是酵母無(wú)法替代的[39-40]。因此,如果利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)酒酒球菌進(jìn)行改造,有利于更高效的進(jìn)行蘋乳發(fā)酵啟動(dòng),同時(shí)酒酒球菌本身也會(huì)賦予葡萄酒更加豐富的香氣成分??墒悄壳坝捎诰凭魄蚓哂猩L(zhǎng)緩慢,不易培養(yǎng)等特點(diǎn),同時(shí)又缺乏相關(guān)的載體,因此對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)化存在相當(dāng)大的困難。

        5 結(jié)語(yǔ)

        酒酒球菌作為葡萄酒蘋乳發(fā)酵的啟動(dòng)者和執(zhí)行者,優(yōu)良菌株的篩選及其釀酒特性一直是人們的研究重點(diǎn)。優(yōu)良酒酒球菌能夠代謝蘋果酸、糖、含氮物質(zhì)等,產(chǎn)生的次級(jí)代謝物能夠豐富葡萄酒風(fēng)味,提高葡萄酒感官品評(píng)。酒酒球菌在復(fù)雜的葡萄酒環(huán)境中,每一個(gè)因素都能影響其生長(zhǎng)繁殖和代謝,各個(gè)因素作用機(jī)制尚不明確,這些因素對(duì)酒酒球菌的作用機(jī)理還有待研究。酒酒球菌工程菌株構(gòu)建一直還未明了,如果將有利于葡萄酒香氣的相關(guān)基因表達(dá)到酒酒球菌中,能夠在葡萄酒發(fā)酵的最后階段對(duì)其香氣的形成有很好的塑造作用。因此,未來(lái)對(duì)酒酒球菌的作用機(jī)理研究和工程菌株的構(gòu)建將是其研究重點(diǎn)。

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