侯小娟 吳梅 丁偉 張倫 唐亮

聽力損失是最主要的出生缺陷之一，嚴重影響患者的認知能力和交流能力，大大降低患者的生活質(zhì)量。中國是世界上聽力殘疾人口最多的國家，我國有聽力障礙人口高達2 780萬之多，如此龐大的聾人數(shù)量，給社會以及聾人家庭都帶來了非常嚴重的經(jīng)濟負擔(dān)。通過分子生物學(xué)方法可檢測出耳聾患者及其家屬是否攜帶目前研究的耳聾熱點基因,如GJB2、SLC26A4和mtDNA12SrRNA基因等[1，2],為耳聾患者(或潛在耳聾患者)及其家屬提供用藥、生活注意事項等的科學(xué)指導(dǎo),還能為其提供遺傳咨詢、生育聾兒風(fēng)險率評估、產(chǎn)前診斷、人工耳蝸植入療效預(yù)測等的科學(xué)依據(jù)。

由于特殊的自然條件和民族傳統(tǒng)，形成了新疆地區(qū)相對獨立的遺傳體系，同時，由于新疆地區(qū)特異的地域、環(huán)境以及飲食習(xí)慣，導(dǎo)致該地區(qū)耳聾的發(fā)病具有地域特點。但目前新疆地區(qū)對于耳聾基因的檢測基本只包括GJB2基因(c.35delG，c.176_191del16，c.235delC，c.299_300delAT)、GJB3基因(c.538C>T)、mtDNA12SrRNA基因(c.1494C>T，c.1555A>G)、SLC26A4基因(c.2168A>G，c.IVS7-2A>G)共四個基因九個位點，以往對新疆地區(qū)非綜合征型聾患者進行這四個基因九個位點篩查時檢出率一般都低于20%[3～5]，還有很大比例的耳聾患者未找到相應(yīng)的耳聾致病基因，提示有必要擴大篩查基因及位點的范圍以更廣泛的覆蓋新疆地區(qū)受檢人群。因此本研究擬通過增加GJB2、SLC26A4、mtDNA12SrRNA三個耳聾基因篩查位點，對新疆地區(qū)非綜合征型耳聾患者進行檢測，以便篩選出更多的耳聾基因突變熱點，提高新疆地區(qū)耳聾基因檢測工作的覆蓋率，優(yōu)化耳聾基因篩查策略。

1 資料與方法

1.1研究對象 收集2017年至2018經(jīng)新疆自治區(qū)人民醫(yī)院耳鼻喉診療中心確診的非綜合征型耳聾患者399例，其中男215例，女184例，年齡4個月～72歲，平均12.34±14.53歲，中位數(shù)6歲。漢族92例，維吾爾族273例，哈薩克族27例，回族7例。所有對象均進行純音測聽、聽性腦干反應(yīng)、聲導(dǎo)抗以及畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射測試；所有患者鼓室導(dǎo)抗圖均為A型，耳聲發(fā)射未引出，通過純音測聽以及聽性腦干反應(yīng)測試均診斷為雙側(cè)感音神經(jīng)性聽力損失，按聽力損失分級標準：輕度(26～40 dB HL)，中度(41～60 dB HL)，重度(61～80 dB HL)，極重度(≥81 dB HL)，399例患者中輕度聽力損失16例(4.01%)，中度聽力損失40例(10.03%)，重度聽力損失78例(19.55%)，極重度聽力損失265例(66.42%)。

1.2耳聾基因檢測

1.2.1使用Primer 5.0軟件進行PCR位點的引物設(shè)計和合成，選擇檢測突變位點包括GJB2基因：c.35delG，c.167delT，c.176_191del16，c.235delC，c.299_300delAT；SLC26A4基因：c.281C>T，c.589G>A，c.IVS7-2A>G，c.1174A>T，c.1226G>A，c.1229C>T，c.IVS15+5G>A，c.1975G>C，c.2027T>A，c.2162C>T，c.2168A>G；mtDNA12SrRNA基因：c.1494C>T，c.1555A>G，c.1585A>G，c.1047A>G，c.1095T>C，c.960_961insC/c.961delT，引物信息見表1。

1.2.2采集399例非綜合征型聾患者的外周靜脈血2 ml于EDTA抗凝管中,利用基因組提取試劑盒(康為世紀全血DNA提取試劑盒)從300 μl患者全血中提取基因組DNA(內(nèi)含線粒體DNA)；以基因組DNA為模板利用所設(shè)計引物進行PCR擴增、產(chǎn)物純化和Sanger測序工作(測序儀為3130DX)，根據(jù)測序結(jié)果進行目標位點多態(tài)性的分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，不同民族差異比較采用χ2檢驗，當(dāng)有理論頻數(shù)<5時，使用Fisher確切概率法檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1399例對象耳聾基因檢測結(jié)果 399例非綜合征型耳聾患者GJB2、SLC26A4、mtDNA12SrRNA3個耳聾常見致病基因共篩查出陽性突變患者98例，突變攜帶率24.56%(98/399)，致病突變頻率為12.78%(51/366)；其中GJB2突變攜帶率為11.28%(45/399)，致病突變頻率為6.52%(26/399)，包括純合突變22例，復(fù)合雜合突變4例。SLC26A4突變攜帶率為10.78%(43/399)，致病突變頻率為3.76%(15/399)，包括純合突變4例，復(fù)合雜合突變11例。mtDNA12SrRNA基因總突變攜帶率為4.76%(19/399)，致病突變頻率為3.51%(14/399)(表2)。

表1 GJB2、SLC26A4、mtDNA12SrRNA基因引物序列信息

表2 3個耳聾基因突變位點及基因突變類型例數(shù)和突變攜帶率(例)

2.2GJB2、SLC26A4、mtDNA12SrRNA基因及各突變位點在不同民族中檢出結(jié)果GJB2基因突變在回族中檢出1例，在哈薩克族中未檢出相關(guān)突變；SLC26A4基因突變在回族中檢出1例，在哈薩克族中檢出2例；在回族和哈薩克族中均未檢測出mtDNA12SrRNA相關(guān)突變。由于回族和哈薩克族患者樣本量較少，因此僅對漢族和維吾爾族進行統(tǒng)計學(xué)分析，GJB2基因、SLC26A4基因突變在漢族和維吾爾族中的檢出率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)，mtDNA12SrRNA基因突變兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

表3 GJB2、SLC26A4、mtDNA12SrRNA基因突變在漢、維族的檢出例數(shù)及檢出率(例，%)

在漢、維族中突變頻率最高的位點都是GJB2基因的c.235delC，其次為SLC26A4基因的c.IVS7-2A>G。在漢族和維吾爾族中GJB2的c.235delC(χ2=9.498、P=0.002)、SLC26A4的c.IVS7-2A>G(χ2=8.729、P=0.003)、c.2168A>G(P=0.001)檢出率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，其他突變位點在漢、維族中檢出率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(表4)。

表4 GJB2、SLC26A4、mtDNA12SrRNA基因各突變位點在漢、維族的檢出例數(shù)及檢出率(例，%)

3 討論

GJB2基因編碼縫隙連接蛋白Cx26，并與相鄰細胞的縫隙連接蛋白組成通道，是電解質(zhì)、第二信使和代謝產(chǎn)物在細胞間轉(zhuǎn)換的重要通道[6]。紀育斌等[7]將我國近10年來與GJB2基因突變有關(guān)的流行病學(xué)文獻相關(guān)數(shù)據(jù)進行總結(jié)，分析發(fā)現(xiàn)GJB2基因總體致病突變攜帶頻率為19.41%，總體致病突變頻率為12.88%，GJB2基因最常見的突變方式是c.235delC，其次是c.299_300delAT、c.176_191del16bp和c.35delG。本研究新疆地區(qū)399例非綜合征型耳聾患者GJB2基因突變攜帶頻率為11.28%，致病突變頻率為6.52%，低于紀育斌等總結(jié)的數(shù)據(jù)，可能與新疆地區(qū)為少數(shù)民族聚居區(qū)有關(guān)，但主要突變位點一致，其中c.235delC突變率最高；而此次篩查中未發(fā)現(xiàn)c.167delT突變。

SLC26A4基因的突變會導(dǎo)致大前庭水管綜合征(enlarged vestibular aqueduct, EVA)和Pendred綜合征[8，9]。自從1997年被鑒定以來，在世界范圍內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)500多種SLC26A4基因突變位點。SLC26A4基因突變具有等位基因異質(zhì)性的特點，不同地域、種族其基因具有不同的突變譜[10～12]，c.IVS7-2A>G是中國人群中最常見的突變位點，且我國地域遼闊、民族眾多，同一地區(qū)不同民族以及同一民族不同地區(qū)的基因突變陽性率都有差異[13]。本組對象SLC26A4基因總突變攜帶率為10.78%，致病突變頻率為3.76%，其中c.IVS7-2A>G突變率為5.76%，c.1174A>T突變率為2.26%，c.2027T>A突變率為2.01%，c.2168A>G突變率為1.5%，c.1226G>A突變率為1.25%，c.1975G>C和c.589G>A突變率僅為0.5%和0.25%，未發(fā)現(xiàn)c.281C>T、c.1229C>T、c.IVS15+5G>A、c.2162C>T突變，后續(xù)耳聾基因篩查中在原有篩查位點c.IVS7-2A>G和c.2168A>G的基礎(chǔ)上可考慮添加c.1174A>T和c.2027T>A突變位點。

線粒體基因突變是藥物性聾的分子基礎(chǔ)，在母系遺傳的氨基糖苷類抗生素致聾家系中進行的線粒體基因組上的突變分析識別出多個mtDNA的突變位點，包括mtDNA12SrRNA基因的c.A1555G和c.C1494T[14]、c.T1095C、c.960_961insC、c.961delT等位點[15，16]。本課題組于2012年對烏魯木齊地區(qū)609例耳聾患者及378例聽力正常母系家庭成員進行藥物性耳聾基因篩查，除了檢測出上述mtDNA12SrRNA突變位點外，還發(fā)現(xiàn)了保守指數(shù)高達100%的c.A1047G，以及能夠破壞mtDNA12SrRNA二級結(jié)構(gòu)上原有配對且暫無報道的c.A1585G突變，這兩種突變是否與耳聾相關(guān)，尚不清楚[17]，因此，本研究將這兩個位點納入了檢測范圍中，以期發(fā)現(xiàn)這兩個位點的更多信息；通過檢測發(fā)現(xiàn)c.1555A>G突變率為2.01%，c.960_961insC/961delT突變率為2.76%，c.1095T>C突變率為0.75%，c.1585A>G突變率為0.25%，未發(fā)現(xiàn)c.1494C>T和c.1047A>G突變。攜帶c.1585A>G突變的患者同時攜帶SLC26A4基因c.2027T>A突變，為大前庭水管綜合征患者，因此，可排除c.1585A>G突變在該患者耳聾形成中發(fā)揮主要作用。針對mtDNA12SrRNA突變陽性患者及其家屬進行宣教，使其母系家庭成員避免接觸氨基糖苷類抗生素，可以有效預(yù)防藥物性耳聾的發(fā)生和發(fā)展。

新疆作為多民族聚居區(qū)域，不同人群的遷移、各民族間婚配造成了較為廣泛的基因交流，增加了該地區(qū)人群基因結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，各民族耳聾基因突變也存在一定差異性。本研究通過對漢族和維吾爾族中GJB2、SLC26A4及mtDNA12SrRNA基因各位點突變率進行對比發(fā)現(xiàn)，漢族GJB2基因和SLC26A4基因突變檢出率顯著高于維吾爾族，而mtDNA12SrRNA基因突變在兩個民族的檢出率無顯著差異；通過分析兩個民族中各個耳聾基因突變位點的檢出率發(fā)現(xiàn)，c.235delC和c.IVS7-2A>G均為兩個民族中的熱點突變；在漢族中c.2168A>G也為熱點突變位點，而在維吾爾族中c.1174A>T、c.35delG、c.2027T>A等多個位點都呈現(xiàn)出熱點突變位點的趨勢，這種情況是否與不同民族起源與進化有關(guān)，有待進一步研究。在漢族中GJB2基因的c.235delC突變、SLC26A4的c.IVS7-2A>G和c.2168A>G突變的檢出率顯著高于維吾爾族，與戴樸等[18，19]研究結(jié)果一致，其他突變位點在兩個民族中均無顯著性差異。這些結(jié)果將有助于優(yōu)化新疆地區(qū)非綜合征型耳聾患者耳聾基因篩查的策略及檢測方法，為因地制宜的制定耳聾基因檢測方案提供依據(jù)。

本研究尚存在問題與不足，所采用的對特定突變位點的檢測方法相對落后，不利于發(fā)現(xiàn)新的突變位點，也不利于提供準確的臨床基因診斷，因此,后續(xù)研究中應(yīng)系統(tǒng)的進行耳聾相關(guān)基因的全序列分析，有效的掌握本地區(qū)耳聾基因的突變類型及突變熱點，為新疆地區(qū)不同民族的耳聾基因突變圖譜的繪制提供依據(jù)。