周玉麗， 顧安樂， 李 媛， 許 濤， 錢海珍， 楊磊， 舒英杰*

(1.安徽科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院, 安徽 鳳陽 233100；2.安徽瑞成福田農(nóng)業(yè)科技有限公司，安徽 合肥 230000；3.安徽皖北老家農(nóng)業(yè)科技有限公司，安徽 臨泉 236400)

根用芥菜(Brassicajunceavar. megarrhiza Tsen et Lee)原產(chǎn)于我國,又名辣疙瘩、大頭芥等,是芥菜以肉質(zhì)根為食用器官的一個變種[1-2]。芥菜營養(yǎng)豐富,富含VC、礦物質(zhì)、微量元素、糖類及蛋白質(zhì)等[3],芥菜具有生津開胃、下氣消食、利尿除濕、溫脾暖胃,清熱解毒、抗菌消腫等功效[4]。近年來隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整和地方特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,根用芥菜已成為安徽阜陽及周邊地區(qū)新興的特色產(chǎn)業(yè),“碗北老家”品牌的芥菜絲深受消費者青睞,遠(yuǎn)銷蘇浙滬及長三角地區(qū),為當(dāng)?shù)孛撠氈赂缓袜l(xiāng)村振興帶來新的經(jīng)濟(jì)增長點。

根用芥菜為異花授粉植物,由于連年種植會發(fā)生生物學(xué)混雜和品種退化現(xiàn)象,而且容易出現(xiàn)黑心病,嚴(yán)重制約了當(dāng)?shù)馗媒娌水a(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。采用離體培養(yǎng)的方法生產(chǎn)脫毒苗是克服品種退化的有效方法之一,崔慧琳等[5]選取結(jié)球甘藍(lán)子葉為外植體,比較了不同材料具柄子葉等材料的再生頻率差異,結(jié)果顯示這種十字花科植物其子葉再生頻率較高,可以作為遺傳轉(zhuǎn)化受體。對葉用芥菜或莖用芥菜[6-7]做了較多的研究,但由于基因型差異,關(guān)于根用芥菜子葉節(jié)和下胚軸再生體系的研究尚未見報道。本研究采用正交試驗,以根用芥菜子葉及下胚軸為外植體,研究不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑組合和不同光照條件培養(yǎng)對不定芽誘導(dǎo)率的影響,以期進(jìn)一步提高根用芥菜子葉和下胚軸再生率,建立簡單快速高效的根用芥菜離體再生體系,為根用芥菜脫毒苗生產(chǎn)提供技術(shù)支撐,并為根用芥菜遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用根用芥菜為提純后的安徽阜陽臨泉縣花葉地方品種。

1.2 試驗方法

1.2.1 根用芥菜子葉和下胚軸的獲得 挑選籽粒飽滿的根用芥菜種子,流水30 min清洗后置超凈臺上,用醫(yī)用酒精(75%)消毒30 s,無菌水沖洗數(shù)次,而后在5%的NaClO溶液中浸泡8～10 min,無菌水沖洗5～6次,將種子平鋪在濾紙上,將晾干的種子接種于MS培養(yǎng)基中,接種后5～7 d后獲得無菌苗備用。

1.2.2 培養(yǎng)基的篩選 愈傷組織誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基附加乙烯抑制劑AgNO3(0.0、3.0、5.0 mg/L),植物生長調(diào)節(jié)劑為6-BA(1.0、3.0、5.0 mg/L)和NAA(0、0.2、0.5 mg/L)組合,依此設(shè)計三因素三水平正交實驗,按L9(34)正交設(shè)計表,共設(shè)置9個處理。

不定芽增殖培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基附加植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA(1、2 mg/L)、NAA(0.1 mg/L)、IBA(0.1 mg/L)、IAA(0.2 mg/L)組合。

生根培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基分別附加植物生長調(diào)節(jié)劑IBA(0.1、0.2 mg/L)、NAA(0.1、0.2 mg/L)、IAA(0.1、0.5 mg/L)。

1.2.3 愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽分化 種子發(fā)芽7 d后,選取長勢一致的無菌苗,在超凈工作臺上分別切取子葉(帶葉柄,葉柄長2～3 mm)和下胚軸(長度約3～4 mm)作為外植體,均平放接種于加有不同質(zhì)量濃度植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中,每瓶接種6個外植體,每處理7瓶。培養(yǎng)20 d統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率,培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計不定芽的生長情況并計算誘導(dǎo)率。

1.2.3.1 不同光照預(yù)處理 切取子葉和下胚軸外植體平放接種于最優(yōu)配方培養(yǎng)基中,每瓶接種8個外植體,每處理8瓶。設(shè)3種光照預(yù)培養(yǎng)條件,光照強(qiáng)度分別為2 000～2 500 lx、1 000～1 500 lx和暗培養(yǎng)條件。預(yù)培養(yǎng)10 d后轉(zhuǎn)入的正常光照條件下培養(yǎng),20 d后調(diào)查愈傷組織生長狀況和不定芽分化狀況。

1.2.3.2 不同苗齡對外植體預(yù)培養(yǎng) 接種于MS培養(yǎng)基的芥菜種子,分別以5、7、9 d的苗齡截取其下胚軸接種采用1.2.3中篩選的最佳配方的培養(yǎng)基中,通過觀察外植體愈傷組織誘導(dǎo)和分化情況選出最適宜誘導(dǎo)分化的外植體苗齡。

1.2.3.3 不定芽增殖 切取誘導(dǎo)的不定芽,接種到添加不同濃度植物生長調(diào)劑(6-BA、NAA、IBA和IAA)組合的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)叢生芽,每處理5瓶,每瓶接3個不定芽,接種25 d后觀察生長情況并統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.2.4 不定芽生根及移栽馴化 將不定芽分別接種于生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根,每瓶1個外植體,每處理12瓶,培養(yǎng)20 d后觀察生根情況并計算生根率,具體見表6。將生根幼苗開瓶煉苗2～3 d,移栽至花盆中培養(yǎng)10～15 d后進(jìn)行正常的栽培管理。

1.2.5 培養(yǎng)條件設(shè)定 試驗以MS為基本培養(yǎng)基,調(diào)節(jié)pH值5.8～6.0,光照2 000～2 500 lx(不同光照預(yù)處理時,光照強(qiáng)度分別為2 000～2 500 lx(CK)、1 000～1 500 lx和暗培養(yǎng)條件),培養(yǎng)溫度(25±2) ℃,14 h/d,相對濕度60%左右。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物生長調(diào)節(jié)劑種類及質(zhì)量濃度配比對根用芥菜不定芽誘導(dǎo)的影響

2.1.1 對子葉不定芽誘導(dǎo)的影響 由圖1可得：接種3 d后外植體明顯膨大,綠色加深,7 d后愈傷包裹子葉外植體表面,傷口處愈傷生長最為明顯,14 d左右,愈傷呈現(xiàn)瘤狀突起(圖1b)。由表1可知：6-BA、NAA和AgNO3的極差R值分別為19.05、9.52和30.95,即3因素對子葉外植體的不定芽誘導(dǎo)率的影響效應(yīng)由大到小依次為:AgNO3質(zhì)量濃度、6-BA質(zhì)量濃度和NAA質(zhì)量濃度。在一定AgNO3質(zhì)量濃度范圍內(nèi),芽誘導(dǎo)率隨AgNO3濃度升高而增加,不加AgNO3(A1、A5、A9)的組合,誘導(dǎo)率在2.38%以下,當(dāng)AgNO3超過3 mg/L則表現(xiàn)抑制作用。從K值大小可知,根用芥菜子葉不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的最優(yōu)植物生長調(diào)節(jié)劑組合為5.0 mg/L 6-BA、0.5 mg/L NAA和3.0 mg/L AgNO3,芽誘導(dǎo)率達(dá)19.05%,且不定芽較健壯(圖1d)。

圖1 根用芥菜愈傷組織的誘導(dǎo)及植株再生

表1 植物生長調(diào)節(jié)劑濃度配比對根用芥菜子葉不定芽誘導(dǎo)的影響

2.1.2 對下胚軸不定芽誘導(dǎo)的影響 接種7 d后下胚軸外植體兩端傷口膨大,長出愈傷,14 d左右白色愈傷組織逐漸覆蓋整個下胚軸外植體(圖1c),隨培養(yǎng)時間的延長,約25 d時,淡黃色愈傷組織逐漸分化出綠色芽點,后期分化成苗。由表3可知,6-BA、NAA和AgNO3的極差R值分別為11.90、19.05和35.71,即3個因素對下胚軸的不定芽誘導(dǎo)率的影響效應(yīng)大小依次為:AgNO3、NAA和6-BA。9個組合中,不加AgNO3的處理中不定芽誘導(dǎo)率最高只有4.76%,MS附加5.0 mg/L 6-BA、0.5 mg/L NAA、3.0 mg/L AgNO3的培養(yǎng)基對下胚軸愈傷組織的誘導(dǎo)率最高達(dá)到26.19%,高于其他組合,其下胚軸分化出的不定芽如圖1e。

表2 植物生長調(diào)節(jié)劑濃度配比對根用芥菜下胚軸不定芽誘導(dǎo)的影響

綜合表1～2可知,根用芥菜子葉和下胚軸不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+5.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+3 mg/L AgNO3;根據(jù)因素內(nèi)水平極差大小可知,乙烯抑制劑AgNO3質(zhì)量濃度對于芥菜組培分化誘導(dǎo)率有更重要的作用。

2.2 不同光照預(yù)培養(yǎng)對根用芥菜不定芽誘導(dǎo)的影響

根用芥菜子葉和下胚軸在不同光照條件下預(yù)培養(yǎng)10 d后的誘導(dǎo)和分化情況見表3。在暗培養(yǎng)處理下,子葉和下胚軸分化率均最低(子葉沒有分化,下胚軸分化率為9.38%),愈傷為白色,疏松,部分死亡;光培養(yǎng)(1 000～1 500 lx)的條件下,子葉和下胚軸愈傷均為淡黃色,較緊實,分化率分別為9.52%和39.04%;光培養(yǎng)(2 000～2 500 lx)條件下,子葉和下胚軸愈傷均為黃綠色,比較緊實,分化率分別為16.67%和23.44%。因此可知,根用芥菜子葉在正常光下不定芽分化率最高達(dá)到16.67%,下胚軸在光培養(yǎng)(1 000～1 500 lx)條件下不定芽分化率最高達(dá)到39.04%。

表3 不同光照預(yù)培養(yǎng)對根用芥菜不定芽誘導(dǎo)的影響

2.3 不同苗齡對根用芥菜不定芽誘導(dǎo)的影響

苗齡對根用芥菜子葉及下胚軸外植體分化率有一定的影響,本試驗分別接種了苗齡5、7、9 d的子葉和下胚軸,觀察其愈傷組織生長情況及外植體愈傷誘導(dǎo)率和分化率。由表5可知,苗齡對愈傷誘導(dǎo)率沒有影響,不同苗齡的子葉和下胚軸的愈傷誘導(dǎo)率均為100%;苗齡對子葉和下胚軸的分化率有一定的影響,5 d苗齡的子葉分化率最大(16.67%),7 d苗齡的下胚軸分化率最大(21.43%)。

表4 不同苗齡對根用芥菜不定芽的誘導(dǎo)的影響

2.4 植物生長調(diào)節(jié)劑種類及濃度配比對根用芥菜不定芽增殖的影響

由表5可以知,當(dāng)不定芽接種在含有1 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA的培養(yǎng)基后,叢生芽的誘導(dǎo)率達(dá)到最大值93.33%,但增殖倍數(shù)為僅有2.67;當(dāng)6-BA的濃度為1mg/L、IAA濃度為0.2 mg/L時,叢生芽的增殖倍數(shù)最高(6.05倍);當(dāng)6-BA的濃度為1 mg/L、IBA濃度為0.1 mg/L時叢生芽的誘導(dǎo)率最低,僅為60%。通過比較發(fā)現(xiàn),添加6-BA和IAA的C5和C6處理的增殖倍數(shù)和平均芽數(shù)都高于前4個處理,添加NAA的處理叢生芽出現(xiàn)不同程度的玻璃化現(xiàn)象,且在基部愈傷組織嚴(yán)重,不利于其增殖。綜合以上,認(rèn)為根用芥菜不定芽最佳增殖培養(yǎng)基為添加1 mg/L的 6-BA和0.2 mg/L的 IAA的MS培養(yǎng)基。

表5 植物生長調(diào)節(jié)劑濃度配比對根用芥菜不定芽增殖的影響

2.5 植物生長調(diào)節(jié)劑種類及濃度配比對根用芥菜生根培養(yǎng)的影響

不同植物生長調(diào)節(jié)劑種類及濃度配比對根用芥菜不定芽生根的影響見表6。接種5～7 d左右部分處理有不定根長出,14 d后,添加了NAA和IAA的處理D3-D6,在外植體接觸培養(yǎng)基的部分長有不同程度愈傷,且未見不定根形成;不加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的CK,生根率為20.83%;處理D1和D2組培苗生長健壯,添加0.2 mg/L IBA生根率達(dá)91.67%,且無明顯愈傷(圖1f)。由此可見,添加0.2 mg/L IBA的MS培養(yǎng)基適合其生根培養(yǎng)。生根培養(yǎng)25 d后的組培苗開瓶煉苗3～5 d,轉(zhuǎn)入盆栽中,幼苗生長良好,栽培成活率達(dá)到100%(圖1g)。

表6 植物生長調(diào)節(jié)劑濃度配比對根用芥菜生根培養(yǎng)的影響

3 結(jié)論與討論

植物離體培養(yǎng)過程中光照條件是不能被任何植物生長調(diào)節(jié)劑所替代,外植體的不同培養(yǎng)階段對光照要求也不同[8]。楊晶等[9]研究表明,黑暗培養(yǎng)有利于愈傷組織和根的生長,但不利于不定芽的分化。師校欣等[10]研究表明,新紅星蘋果莖尖外植體接種和生根階段,1周暗培養(yǎng)有利于莖尖分化和不定根誘導(dǎo);易麗娟等[11]研究表明,2 000 lx的光照適合紅花外植體生長;1 500～2 000 lx的光照更有利于紅花愈傷組織的生根[12]。本試驗結(jié)果表明,根用芥菜子葉在2 000～2 500 lx不定芽分化率最高(16.67%),愈傷生長良好;下胚軸在1 000～1 500 lx光照條件下不定芽分化率最高(39.04%),愈傷生長良好。

培養(yǎng)基中加入不同種類的外源激素及配比,通過改變內(nèi)源激素水平與平衡,對愈傷的形成、不定芽的分化及生根都有影響[13]。不同植物的種類、基因型和外植體等都會影響到外源激素的種類和配比,而且誘導(dǎo)愈傷組織和分化的最適培養(yǎng)基不同。楊潔等[14]年關(guān)于蕪菁的子葉下胚軸的再生體系建立研究表明,不同種類及濃度的激素對該植物下胚軸不定芽再生影響較大。王麗艷等[15]研究表明,誘導(dǎo)芥菜愈傷組織最適培養(yǎng)基為:MS+(0.1 mg/LNAA)+(3 mg/L 6-BA),最適愈傷組織分化培養(yǎng)基為:MS+(0.1 mg/L NAA)+(1 mg/L 6-BA)。本研究結(jié)果表明,根用芥菜子葉和下胚軸最適不定芽分化培養(yǎng)基為MS+(5.0 mg/L 6-BA)+(0.5 mg/L NAA)+(3 mg/L AgNO3),不定芽的增殖效果以MS+(1.0 mg/L 6-BA)+(0.2 mg/L IAA)培養(yǎng)基最佳,生根效果以MS+(0.2 mg/L IBA)培養(yǎng)基最好。

Ag+可以防止外植體產(chǎn)生過多乙烯對植株再生的抑制,是較好的乙烯活性抑制劑[16]。張鵬等[17]研究表明,一定濃度的AgNO3能夠提高體細(xì)胞胚胎和芽發(fā)生的頻率,高濃度的AgNO3則降低再生率。AgNO3對許多單、雙子葉植物的離體再生的促進(jìn)作用已有不少報道,如AgNO3能促進(jìn)小麥[18]、玉米[19]、擬南芥[20]、大白菜[21]、甘藍(lán)[22]、花菜[23]等植物愈傷組織的再生,對難以再生的離體植物,AgNO3對外植體誘導(dǎo)分化起作用更明顯。本試驗結(jié)果表明,AgNO3濃度對根用芥菜子葉和下胚軸體的不定芽誘導(dǎo)率的影響大于6-BA濃度和NAA濃度,在培養(yǎng)基中添加一定濃度的AgNO3,可以提高根用芥菜外植體芽誘導(dǎo)率,當(dāng)AgNO3濃度超過3 mg/L則表現(xiàn)抑制作用。