易俊莉 楊新宇 張潔 田麗麗 丁北川 武文清

非結(jié)核分枝桿菌病與結(jié)核病臨床表現(xiàn)相似，如未能及時準確鑒定極易造成誤診，且非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria，NTM)大多對常見的抗結(jié)核藥品耐藥，只采用常規(guī)抗結(jié)核藥品進行治療療效大多不理想。因此，需要操作簡便、快速、可靠的區(qū)分結(jié)核分枝桿菌復合群(MTBC)與NTM的檢測方法。為此，筆者比較不同原理的3種方法[即：對硝基苯甲酸/噻吩-2-羧酸肼(PNB/TCH)生長試驗法、結(jié)核分枝桿菌抗原(MPB64)檢測法、PCR-熒光探針法]對MTBC和NTM的鑒定結(jié)果，分析其臨床應用價值。

資料和方法

一、菌株來源

11株標準菌株包括MTB標準株H37Rv及10株 NTM標準株(堪薩斯分枝桿菌、戈登分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、偶然分枝桿菌)均來源于國家結(jié)核病參比實驗室。238株臨床分離株為北京結(jié)核病控制研究所2019年1—12月門診患者培養(yǎng)陽性凍存菌株，經(jīng)涂片抗酸染色均為陽性。

二、檢驗方法

1.儀器與試劑：中性羅氏培養(yǎng)基及PNB/TCH培養(yǎng)基由河南賽諾特生物技術有限公司提供。結(jié)核分枝桿菌抗原(MPB64)檢測試劑盒由杭州創(chuàng)新生物檢控技術有限公司提供。PCR-熒光探針法使用Roche LightCycler480儀，試劑盒由成都博奧晶芯生物科技有限公司提供。微陣列基因芯片試劑盒、核酸提取儀、芯片雜交儀、芯片掃描儀由北京博奧生物有限公司提供。

2.菌株復活：從菌株凍存管中取0.1 ml菌液接種在中性羅氏培養(yǎng)基中，37 ℃孵育2～4周，每周觀察生長情況，直至長出可視菌落。

3.PNB/TCH生長試驗：按照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[1]進行。取中性羅氏培養(yǎng)基中復活的單個菌落加入無菌生理鹽水制成1 mg/ml菌液。將稀釋成10-2mg/ml的菌液各取0.1 ml分別接種于中性羅氏培養(yǎng)基與PNB/TCH培養(yǎng)基上，37 ℃孵育4周，觀察菌落生長情況。PNB/TCH生長者判定為NTM，PNB未生長TCH生長判定為MTBC，中性羅氏培養(yǎng)基無生長時需重新檢測。

4.MPB64檢測法：在試管中加入0.2 ml生理鹽水及中性羅氏培養(yǎng)基中復活的單個菌落，加蓋后用渦旋混合器充分混合制成待測樣本。將100 μl樣本滴入檢測板的加樣孔內(nèi)，反應15 min，觀察結(jié)果。陽性：檢測線(T)及質(zhì)控線(C)都出現(xiàn)紫紅色條帶。陰性：檢測線(T)處沒有出現(xiàn)紫紅色條帶，只有質(zhì)控線(C)處出現(xiàn)紫紅色條帶。如質(zhì)控線沒有顯示條帶時使用其他檢測板重新檢測。陽性結(jié)果判定為MTBC，陰性結(jié)果判定為NTM。

5.PCR-熒光探針法：取中性羅氏培養(yǎng)基中復活的單個菌落及50 μl核酸提取液加入核酸提取管中，放入核酸提取儀震蕩5 min，95 ℃水浴5 min，3000×g離心1 min。取2 μl核酸樣本加入18 μl擴增反應液管后放入實時熒光定量PCR儀。設置PCR擴增程序：37 ℃ 5 min、94 ℃ 3 min后，94 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s，40個循環(huán)，50 ℃ 10 s。檢測通道同時選擇羧基熒光素(FAN)和六氯熒光素(HEX)通道，熒光采集點選擇60 ℃ 30 s。樣本擴增曲線呈S型，且循環(huán)閾值(Ct值)<40判定為陽性，擴增曲線不呈S型或Ct值≥40(或無任何數(shù)值)判定為陰性。FAM通道陽性，HEX通道陽性或陰性，判定為MTBC。FAM通陰性，HEX通道陽性，判定為NTM。FAM通道陰性，HEX通道陰性判定為分枝桿菌核酸檢測陰性。

6.微陣列基因芯片檢測：核酸提取方法同PCR-熒光探針法。將提取的2 μl模版DNA加入至18 μl反應體系中，按試劑盒說明書進行PCR擴增。取6 μl PCR擴增產(chǎn)物、9 μl雜交緩沖液制成雜交反應混合物，從蓋片的加樣孔加入，50 ℃雜交2 h。雜交結(jié)束后用十二烷基硫酸鈉洗液和檸檬酸鈉洗液沖洗干凈，用晶芯MTB檢測芯片系統(tǒng)進行結(jié)果判讀。

三、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行分析。計數(shù)資料以“率(%)”表示。以微陣列基因芯片鑒定結(jié)果為參照，計算PNB/TCH生長試驗法、MPB64檢測法、PCR-熒光探針法對MTBC的檢測效能，計算公式：敏感度(%)=真陽性株數(shù)/(真陽性株數(shù)+假陰性株數(shù))×100%；特異度(%)=真陰性株數(shù)/(真陰性株數(shù)+假陽性株數(shù))×100%；符合率(%)=(真陽性株數(shù)+真陰性株數(shù))/總株數(shù)×100%；陽性預測值(%)=真陽性株數(shù)/(真陽性株數(shù)+假陽性株數(shù))×100%；陰性預測值(%)=真陰性株數(shù)/(真陰性株數(shù)+假陰性株數(shù))×100%。采用Kappa值進行一致性檢驗，Kappa值≥0.75時表示一致性較好。

結(jié) 果

一、標準菌株檢測結(jié)果

10株NTM標準菌株及MTB標準株經(jīng)PNB/TCH生長試驗法、MPB64檢測法、PCR-熒光探針法均正確判定。238株臨床分離株中，PNB/TCH生長試驗法檢出207株(87.0%)MTBC、31株(13.0%)NTM；MPB64檢測法檢出203株(85.3%)MTBC，35株(14.7%)NTM；PCR-熒光探針法檢出206株(86.6%)MTBC，32株(13.4%)NTM。有4株菌應用PNB/TCH生長試驗法、MPB64檢測法、PCR-熒光探針法檢測結(jié)果不一致，其中3株MPB64檢測結(jié)果為NTM菌株，PNB/TCH生長試驗和PCR-熒光探針法檢測結(jié)果為MTBC，后經(jīng)微陣列基因芯片鑒定確認為MTB；1株菌PNB/TCH生長試驗法檢測結(jié)果為MTBC，MPB64檢測和PCR-熒光探針法檢測結(jié)果為NTM，后經(jīng)微陣列基因芯片鑒定確認為堪薩斯分枝桿菌。

二、檢測效能分析

以微陣列基因芯片法鑒定結(jié)果為參照標準，PNB/TCH生長試驗法檢測MTBC的敏感度為100.0%(206/206)、特異度為96.9%(31/32)；MPB64檢測法檢測MTBC的敏感度為98.5%(203/206)、特異度為100.0%(32/32)；PCR-熒光探針法檢測MTBC的敏感度為100.0%(206/206)、特異度為100.0%(32/32)；Kappa值分別為0.98、0.95、1.00(表1)。

三、方法可實施性分析

PNB/TCH生長試驗法、MPB64檢測法、PCR-熒光探針法檢測周期分別為28 d、0.5 h、0.5 d，檢測平均成本分別為20、40、60元。PNB/TCH生長試驗法和MPB64檢測法需要得到培養(yǎng)物才能進行檢測。PCR-熒光探針法需要實驗室及操作人員具有專業(yè)的核酸檢測能力(表2)。

表1 以微陣列基因芯片法為參照標準評價3種檢驗方法檢測MTBC的效能

表2 PNB/TCH生長試驗法、MPB64檢測法、PCR-熒光探針法可實施性比較

討 論

本研究以微陣列基因芯片法鑒定結(jié)果為參照標準，分析比較了三種不同原理的MTBC和NTM鑒定方法的檢測效能及可實施性。PNB/TCH生長試驗法是最傳統(tǒng)的鑒定MTBC的方法，其是利用MTBC在含有PNB培養(yǎng)基中生長受到抑制，大多數(shù)NTM對一定濃度的PNB有耐藥性的原理，從而鑒別MTBC與NTM。MPB64檢測法檢測對象為培養(yǎng)物中的結(jié)核分枝桿菌抗原MPB64(又稱MPT64)，是MTBC分泌的一種特異性分泌蛋白，而NTM不分泌。PCR-熒光探針法采用雙重PCR技術和Taqman探針技術相結(jié)合的原理，對樣本中提取的分枝桿菌核酸進行定性檢測。

本次研究中，PNB/TCH生長試驗法檢測MTBC 的敏感度為100.0%，特異度為96.9%。其中，1株菌PNB/TCH生長試驗法檢測結(jié)果為MTBC，MPB64檢測法和PCR-熒光探針法檢測結(jié)果為NTM，經(jīng)微陣列基因芯片法最終菌種鑒定為堪薩斯分枝桿菌，說明PNB/TCH生長試驗法作為MTBC與NTM鑒別試驗存在局限性，部分NTM可能被錯誤歸類為MTBC，與李國利等[2]的報道一致。吳龍章等[3]分析認為，需要光學照射才能產(chǎn)生色素的光產(chǎn)色性分枝桿菌菌群(如堪薩斯分枝桿菌)在實驗室中未經(jīng)光學照射易誤判為MTBC，從而導致檢驗結(jié)果出現(xiàn)錯誤。當比例法藥敏試驗顯示多種藥品耐藥而PNB顯示敏感，且對照管生長的菌落為細小菌落或產(chǎn)色時，應高度懷疑為NTM，為避免結(jié)果差錯，建議采用其他方法進一步驗證。

MPB64檢測法檢測MTBC的敏感度為98.5%，特異度為100.0%。其中，有3株假陰性結(jié)果，即MPB64檢測法檢測結(jié)果為NTM，PNB/TCH生長試驗法、PCR-熒光探針法檢測結(jié)果為MTBC，經(jīng)微陣列基因芯片法最終菌種鑒定為MTBC，該現(xiàn)象此前也有報道。分析其主要原因，可能為MTB中的MPB64編碼基因突變，如63 bp缺失，造成出現(xiàn)檢測假陰性結(jié)果[4-7]。MPB64檢測法除了可以利用固體培養(yǎng)基上的菌落進行檢測，也可以采用抗酸桿菌培養(yǎng)物的懸濁液或者培養(yǎng)液直接作為樣本使用。因此，適用于BACTEC MIGIT 960培養(yǎng)陽性后藥物敏感性試驗前的菌種初步鑒定，可縮短檢測周期。但對生長指數(shù)較低的樣本，應適當延長培養(yǎng)時間，以避免假陰性產(chǎn)生[8-9]。液體培養(yǎng)法MTB涂片鏡檢多呈索狀排列，NTM多呈團塊狀排列或散在分布，因此，當MPB64檢測法檢測結(jié)果與涂片鏡檢形態(tài)結(jié)果不一致時，建議采用其他方法進一步確認。

PCR-熒光探針法具有較高的敏感度和特異度?！禬S 288—2017肺結(jié)核診斷》[10]也已將分枝桿菌核酸檢測納入結(jié)核病病原學檢查范疇。核酸擴增法可以利用臨床痰標本直接進行檢測，作為痰涂片和培養(yǎng)的補充，對結(jié)核病病原學快速檢測具有重要的臨床應用價值[11]。同時，因無需使用陽性培養(yǎng)物進行檢測，可大幅縮短檢測周期，為患者早期診斷和制定化療方案提供依據(jù)。

在各實驗室技術可實施性方面，PCR-熒光探針法檢測耗時短，總檢測時間僅需要0.5 d，但操作較為復雜，需要實驗室及操作人員具有專業(yè)的核酸檢測能力，且前期設備儀器投入較大，造成檢測成本相對較高,在基層實驗室推廣使用尚需時日。MPB64檢測法操作更為簡便，只需在生物安全柜內(nèi)將樣本滴入加樣孔后15 min即可觀察結(jié)果，總檢測時間不超過30 min。同時，該方法對實驗人員和實驗輔助設備要求相對不高，試劑盒可常溫保存，費用合理，更適用于標本量較多且檢測條件有限的基層實驗室。PNB/TCH生長試驗法具有操作簡單、費用低的優(yōu)勢，但培養(yǎng)判定所需時間較長(28 d)，在快速鑒別診斷中并無優(yōu)勢。

綜上所述，三種方法均可用于MTBC與NTM的鑒定，各具優(yōu)勢。PCR-熒光探針法敏感度和特異度高，檢測結(jié)果較其他兩種方法更為準確可靠，適合具有核酸檢測能力的實驗室使用。MPB64檢測法操作簡便、快速、價格低廉，更適合標本量大且檢測能力有限的基層實驗室進行初步鑒定使用。