冠心病是多基因遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的疾病[1]，其中代謝異常與冠心病不同進(jìn)展階段密切相關(guān)[2]。代謝組學(xué)系統(tǒng)反映體內(nèi)小分子代謝物變化，有助于發(fā)現(xiàn)與疾病發(fā)生及診治相關(guān)的生物標(biāo)志物[3]。本研究利用超高效液相色譜—飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（UHPLC-QTOF/MS）技術(shù)分析冠心病不同進(jìn)展階段患者血漿代謝圖譜變化，探索與冠心病發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的代謝物。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

篩選2013 年5 月至2015 年3 月于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院接受冠狀動(dòng)脈造影患者中選擇至少一支主支冠狀動(dòng)脈狹窄50%～70%的臨界病變患者19例（臨界組），根據(jù)性別年齡1:1 匹配的冠狀動(dòng)脈正常者20 例（正常組）和罪犯血管狹窄80%～100%的急性心肌梗死患者18 例（心肌梗死組），共57 例，其中男性31 例，女性26 例。所有患者均排除其他器質(zhì)性心臟病、免疫及代謝性疾病。研究經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)：2012-431）。

1.2 樣本準(zhǔn)備

患者冠狀動(dòng)脈造影前取靜脈血5 ml，4℃ 2 300 rpm 離心10 min 分離血漿，12 000 rpm 離心15 min，取400 μl 上清液-80℃保存。從所有待測(cè)樣本中各取10 μl 混合為質(zhì)量控制標(biāo)本（quality control，QC）。

1.3 UHPLC-QTOF/MS 檢測(cè)

利用超高效液相色譜系統(tǒng)（型號(hào)：1290 UHPLC，品牌：Agilent）和高分辨質(zhì)譜系統(tǒng) （型號(hào)：Triple TOF 6600，品牌：AB Sciex ）進(jìn)行檢測(cè)。

利用陽(yáng)離子相和陰離子相兩種電離模式聯(lián)合，對(duì)血清進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)離子檢測(cè)。色譜條件：色譜柱Waters ACQUITY UHPLC HSS T3 （2.1×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A 陽(yáng)離子相為0.1%甲酸溶解于水，陰離子相為0.5 mM 氟化銨溶解于水；流動(dòng)相B 陽(yáng)離子相為0.1%甲酸溶解于乙腈溶液，陰離子相為乙腈溶液。序列中每隔8個(gè)檢測(cè)樣插入1個(gè)空白樣（75%乙腈溶液）和1 個(gè)QC 樣，進(jìn)樣量4 μl。質(zhì)譜條件：掃描范圍50～1 200 mz，速率4 質(zhì)譜/s。鞘氣溫度400℃，流速12 L/min；干燥氣溫度250℃，流速16 L/min；噴霧電壓陽(yáng)離子模式20 psi，陰離子模式40 psi；噴嘴電壓0 V。

1.4 數(shù)據(jù)預(yù)處理

使用ProteoWizard 將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為mzXML格式，以XCMS（xcms4 dda、xcms4 lipid）程序檢索自建庫(kù)獲得矩陣數(shù)據(jù)表，包括質(zhì)荷比（m/z）、保留時(shí)間（RT）、峰面積。以CAMERA 軟件做峰篩選，最后用LOESS 模型對(duì)QC 進(jìn)行歸一化處理，棄去匹配度低于80%的數(shù)據(jù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

使用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)于患者基線數(shù)據(jù)，連續(xù)變量采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。計(jì)數(shù)資料應(yīng)用方差分析比較組間差異，分類資料用卡方、或Fisher 檢驗(yàn)（當(dāng)超過(guò)50%單元格理論頻數(shù)小于5時(shí)）比較組間差異，雙側(cè)P＜0.05 為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)代謝物數(shù)據(jù)通過(guò)多元變量統(tǒng)計(jì)分析方法進(jìn)行分析，使用多變量統(tǒng)計(jì)軟件SIMCA-P 14.1 進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），應(yīng)用學(xué)生t檢驗(yàn)分析每種代謝物的顯著性，差異代謝物篩選標(biāo)準(zhǔn)為校正后P值＜0.1，同時(shí)OPLS-DA 模型第一主成分變量投影重要度（VIP）＞1.0。

2 結(jié)果

2.1 三組患者臨床基線資料比較（表1）

三組患者間年齡、性別構(gòu)成、體重指數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與正常組相比，臨界組和心肌梗死組合并高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙及冠心病家族史等危險(xiǎn)因素比例有增加趨勢(shì)。

2.2 冠心病不同階段患者差異代謝物鑒定（圖1）

共618 種代謝物納入冠心病不同進(jìn)展階段血漿代謝組學(xué)分析，其中正常組與臨界組、正常組與心肌梗死組、臨界組與心肌梗死組的組間差異代謝物分別為91 種、52 種、148 種。

表1 三組患者臨床基線資料比較[例（%）]

圖1 正常組與臨界組、正常組與心肌梗死組、臨界組與心肌梗死組的組間差異代謝物篩選火山圖

正常組與臨界組及正常組與心肌梗死組的差異代謝物（表2）：正常組與臨界組及正常組與心肌梗死組的差異代謝物交集共有6 種。與正常組相比，臨界組與心肌梗死組均上調(diào)物質(zhì)包括棕櫚酸、1-硬脂酰-SN-甘油-3-磷酰膽堿、L-酪氨酸、N4-乙酰胞嘧啶核苷，下調(diào)物質(zhì)包括L-丙氨酸、阿卡地辛。臨界組與心肌梗死組均存在冠狀動(dòng)脈狹窄，因此考慮該6 種物質(zhì)與冠心病發(fā)生相關(guān)。

表2 正常組與臨界組及正常組與心肌梗死組的6 種差異代謝物表達(dá)列表

正常組與臨界組及臨界組與心肌梗死組的差異代謝物：正常組與臨界組及臨界組與心肌梗死組的差異代謝物交集僅1 種，即L-苯丙氨酸，且L-苯丙氨酸表達(dá)量隨冠心病加重，在正常組、臨界組、心肌梗死組表達(dá)量依次下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（臨界組vs.正常組：VIP 1.48，P=0.090，差異表達(dá)倍數(shù)：0.92；心肌梗死組vs.臨界組：VIP 1.42，P=0.004，差異表達(dá)倍數(shù)0.80），提示L-苯丙氨酸可能參與冠心病的進(jìn)展。

3 討論

研究篩選出冠心病進(jìn)展不同階段的交集差異代謝物共7 種。其中棕櫚酸、1-硬脂酰-SN-甘油-3-磷酰膽堿的變化同我們前期對(duì)嚴(yán)重冠心病患者代謝物的研究相一致[4]。而L-酪氨酸、L-丙氨酸、阿卡地辛等，也分別被證實(shí)在心肌氧化損傷和炎癥反應(yīng)[5]、促進(jìn)冠狀動(dòng)脈病變進(jìn)展[6]、減輕缺血再灌注后心肌細(xì)胞凋亡[7]等方面具有各自的病理學(xué)特征。

Wu 等[8]發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸與動(dòng)脈粥樣硬化患者心血管疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)。在發(fā)生短暫缺血的心絞痛患者，苯丙氨酸也顯著降低[9]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也顯示L-苯丙氨酸作為調(diào)控靶點(diǎn)具有抗組織缺血作用[10]。本研究也發(fā)現(xiàn)隨冠狀動(dòng)脈病變程度加重，L-苯丙氨酸在正常組、臨界組及心肌梗死組水平依次下調(diào)，提示其參與動(dòng)脈粥樣硬化形成，直至冠狀動(dòng)脈重度狹窄而發(fā)生心肌缺血的病理過(guò)程，有可能成為冠心病早期診斷的有效標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

本研究為小規(guī)模對(duì)照觀察性研究，樣本量有限，雖然檢測(cè)出若干具有顯著差異的標(biāo)志物，但尚不能確定其變化同冠心病的病理生理進(jìn)程的因果關(guān)系。未來(lái)將以檢出的標(biāo)志物蛋白為基礎(chǔ)，進(jìn)一步對(duì)其信號(hào)通路及功能意義開展研究，確認(rèn)這些標(biāo)志物與冠心病進(jìn)程的關(guān)系及有效調(diào)控手段。

綜上所述，本研究借助非靶向代謝組學(xué)方法檢測(cè)并分析冠狀動(dòng)脈不同進(jìn)展階段血漿代謝物的差異，首次發(fā)現(xiàn)L-苯丙氨酸是與冠心病進(jìn)展有強(qiáng)關(guān)聯(lián)性的生物標(biāo)志物，為從代謝水平探索冠狀動(dòng)脈疾病發(fā)生發(fā)展病理機(jī)制及新的潛在干預(yù)靶點(diǎn)提供線索。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突