史曉敏 齊瑤

西北民族大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州730000

不孕癥是婦科常見病，在我國發(fā)病率為7%～10%，其誘發(fā)因素涉及排卵、輸卵管、子宮、宮頸、陰道、免疫等，其中輸卵管因素約占不孕因素的50%，輸卵管發(fā)育異常、子宮內(nèi)膜異位癥、輸卵管炎等均可導(dǎo)致輸卵管性不孕［1］。近年來，輸卵管炎性不孕發(fā)病比例有增加趨勢，可能與盆腔感染增加、流產(chǎn)比例上升、環(huán)境污染、生活飲食習(xí)慣異常改變等因素有關(guān)［2］。西醫(yī)多通過抗生素、介入再通術(shù)、腹腔鏡手術(shù)、輔助生殖技術(shù)等方法治療輸卵管炎性不孕，但因創(chuàng)傷性較大、復(fù)發(fā)率較高、費(fèi)用昂貴等，不能廣泛應(yīng)用于臨床［3］。近年來中醫(yī)藥以其毒副作用少、無創(chuàng)性、作用持久、適應(yīng)證廣泛、價(jià)廉等優(yōu)勢受到臨床廣泛關(guān)注。氣滯血瘀型是輸卵管炎性不孕的中醫(yī)證候常見分型，正所謂瘀滯阻于胞宮，精卵無法結(jié)合而致不孕［4］。種子湯是李廣文教授的經(jīng)驗(yàn)方，具有理氣活血、疏肝解郁、化瘀通絡(luò)、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)之功，用于治療排卵功能障礙性不孕療效顯著［5］，但種子湯加減方應(yīng)用于氣滯血瘀型輸卵管炎性不孕治療的報(bào)道甚少。因此，本研究分析了種子湯加減方對氣滯血瘀型輸卵管炎性不孕大鼠血流變學(xué)及纖維化的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 雌性SD大鼠75只，健康，SPF級，周齡6～8周，體質(zhì)量180g~220g，購于上海捷思英達(dá)醫(yī)藥技術(shù)有限公司（許可證號：SYXK（滬）2019-0031）。所有大鼠飼養(yǎng)于動物實(shí)驗(yàn)室中，每5只大鼠一籠飼養(yǎng)，室溫維持在（25±0.5）℃，濕度維持在（55±5）%，晝夜時(shí)差控制在12h：12h，采用大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料飼喂，自由攝食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。

對照組大鼠給予等量生理鹽水；模型組大鼠建立氣滯血瘀型輸卵管炎性不孕大鼠模型；按照“人與動物體表面積折算等效劑量比率表”［7］，配置對應(yīng)低、中、高劑量組大鼠造模后分別給予等效成方濃度1.52g/kg、3.04g/kg、6.08g/kg劑量的種子湯加減方。每組15只。種子湯加減方濃度配置方法：C方=（m草藥-m藥渣）/m液。

1.2 模型制備及藥物干預(yù) 氣滯血瘀型輸卵管炎性不孕大鼠模型建立：腹腔注射10%水合氯醛溶液（0.04mL/kg，南京森貝伽生物科技有限公司），將大鼠麻醉，碘伏常規(guī)消毒術(shù)區(qū)，在腎區(qū)脊柱兩側(cè)旁開1cm處行一橫切口，打開腹腔，找到輸卵管和卵巢，沿輸卵管－卵巢方向，注射0.1mL金黃色葡萄球菌懸液（4×109/mL，上海恒斐生物科技有限公司）至輸卵管，逐層縫合。另外一側(cè)輸卵管采用相同方法處理。大鼠術(shù)后1周給予聲光電、45°斜坡、夾尾聯(lián)合刺激，刺激時(shí)長為3周。聲光電刺激：24～35V電擊刺激，1～3kHz閃爍光刺激，5～15kHz噪聲刺激，刺激時(shí)間為60～120s，每8～15min/次，持續(xù)10～12h；夾尾：使用長鑷夾大鼠尾巴，60min/次，每次4min，每天8次；45°斜坡：傾斜鼠籠45°，每天2h，每天1次。造模成功［6］。造模過程中失敗大鼠剔除，并隨機(jī)補(bǔ)足。

模型組按照上述方法造模，低、中、高劑量組造模后進(jìn)行治療，種子湯加減方（紅藤15g、桃仁10g、丹參30g、柴胡10g、穿山甲10g、王不留行10g、昆布10g、路路通10g、當(dāng)歸10g、香附10g、川芎10g、淮山藥10g、龜板15g；所有中藥材購于山東步長神州制藥有限公司），按照“人與動物體表面積折算等效劑量比率表”［7］，配成低、中、高濃度藥液，分別為浸出有效成分濃度1.52g/kg、3.04g/kg、6.08g/kg（相當(dāng)于成人臨床用量的5倍、10倍、20倍），灌胃體積為1mL/100g，每天1次，連續(xù)治療28天。對照組在造模開始時(shí)給予等量生理鹽水。

1.3 觀察指標(biāo) 分析各組大鼠血流變學(xué)：用10%水合氯醛溶液0.04mL/kg腹腔麻醉，然后在無菌條件下腹主動脈取血，采用GD3LBY-N6K自清洗快測血流變儀（北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司）測定全血黏度3/s、血漿黏度、全血黏度30/s。

觀察各組大鼠輸卵管組織病理變化：將各組5只大鼠處死，取輸卵管組織，10%甲醛溶液固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋成塊，組織切片機(jī)（上海玉研科學(xué)儀器有限公司）切成5μm連續(xù)切片，脫蠟水化，采用HE染色試劑盒（北京祥生興業(yè)科技有限公司）染色，流水沖洗，烘片0.5h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠固封劑（上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司）封片，顯微鏡下觀察HE染色結(jié)果。

比較各組大鼠受孕率：治療結(jié)束后，把各組余下的10只雌性大鼠和雄性大鼠合籠飼養(yǎng)10天，每組分配5只雄性大鼠，以觀察受孕情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（±s）表示，采用F 檢驗(yàn)，各組計(jì)量資料兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠輸卵管組織病理變化 對照組輸卵管結(jié)構(gòu)完整，黏膜清晰，無充血水腫，亦無炎細(xì)胞浸潤；模型組輸卵管結(jié)構(gòu)異常，黏膜上皮細(xì)胞脫落，輸卵管組織粘連及纖維化明顯，血管壁增厚、變硬，可見血管壁充血腫脹，輸卵管管腔內(nèi)及輸卵管周圍可見大量炎細(xì)胞浸潤；各劑量組輸卵管組織病理變化較模型組均有不同程度的改善，其中中劑量組改善程度優(yōu)于低劑量組，高劑量組改善程度優(yōu)于中劑量組。見圖1。

圖1 各組大鼠輸卵管組織病理變化（HE染色×400）

2.2 各組大鼠血流變學(xué)分析 與對照組比較，模型組和各劑量組大鼠全血黏度3/s、血漿黏度、全血黏度30/s高（P＜0.05）；與模型組比較，各劑量組大鼠全血黏度3/s、血漿黏度、全血黏度30/s低（P＜0.05）；與低劑量組比較，中劑量組大鼠全血黏度3/s、血漿黏度、全血黏度30/s低（P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組大鼠全血黏度3/s、血漿黏度、全血黏度30/s低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血流變學(xué)分析（mPa.s）

2.3 各組大鼠受孕率比較 與對照組比較，模型組、低劑量組、中劑量組大鼠受孕率低（P<0.05）；與模型組比較，中劑量組、高劑量組大鼠受孕率高（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠受孕率比較

3 討論

氣滯血瘀型輸卵管炎性不孕在古代醫(yī)學(xué)書籍中屬無子、痛經(jīng)、帶下病等范疇。研究認(rèn)為［8］，此病多因經(jīng)期正行，余血未盡，胞門未閉合完全，濕熱內(nèi)蘊(yùn)，外陰不潔，邪毒乘虛內(nèi)犯，與胞宮、沖任之氣血相搏結(jié)，使氣血運(yùn)行失調(diào)，胞脈受阻，瘀血停滯，不能攝精成孕。中醫(yī)認(rèn)為［9］，“瘀”是本病的發(fā)病機(jī)制，因炎癥常與濕濁之邪關(guān)聯(lián)，濕熱纏綿日久，病久傷絡(luò)，脈絡(luò)不通，不能攝精成孕?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》曰“無子多系沖任瘀血，去瘀血自能有子也”，《針灸甲乙經(jīng)》曰：“女子絕子，其血在內(nèi)不下，受關(guān)元主之”，提出了瘀血可致不孕的理論機(jī)制［10］。報(bào)道認(rèn)為［11］，本病由攝生不慎，感外邪，情志不調(diào)，邪與血相搏結(jié)，血行不暢，沖任胞宮阻滯，精卵難于相搏而致。因此，以“活血化瘀，行氣止痛”為治療本病的基本準(zhǔn)則。種子湯組方包括紅藤、桃仁、丹參、柴胡、穿山甲、王不留行、昆布、路路通、當(dāng)歸、香附、川芎等，其中，丹參養(yǎng)血活血、化瘀消瘀，桃仁活血化瘀，紅藤活血祛瘀，當(dāng)歸補(bǔ)血調(diào)經(jīng)、活血行滯，川芎行氣活血，開郁調(diào)肝，上述諸藥均有化瘀之功，合用有加強(qiáng)破血消瘀作用；柴胡疏肝解郁，香附調(diào)經(jīng)止痛、行氣解郁，昆布和穿山甲味咸，能軟堅(jiān)散結(jié)，外通經(jīng)絡(luò)，王不留行苦泄宣通，長于通利血脈，路路通祛風(fēng)通絡(luò)，上述諸藥合用，能使瘀血隨經(jīng)血而下，胞宮溫養(yǎng)，胞脈通暢。共奏“活血化瘀通絡(luò)”之功，使精卵相合而孕［12］。

本研究中，對照組輸卵管結(jié)構(gòu)完整，黏膜清晰，無充血水腫，亦無炎細(xì)胞浸潤，而模型組輸卵管結(jié)構(gòu)異常，黏膜上皮細(xì)胞脫落，輸卵管組織粘連及纖維化明顯，血管壁增厚、變硬，可見血管壁充血腫脹，輸卵管管腔內(nèi)及輸卵管周圍可見大量炎細(xì)胞浸潤，模型組大鼠全血黏度3/s、血漿黏度、全血黏度30/s較對照組明顯增加，模型組無大鼠受孕，提示氣滯血瘀型輸卵管炎性不孕大鼠模型制備成功。此外，各劑量組輸卵管組織病理變化尤其是組織纖維化較模型組均有不同程度的改善，其中中劑量組改善程度優(yōu)于低劑量組，高劑量組改善程度優(yōu)于中劑量組，提示高劑量的種子湯加減方具有改善輸卵管病理、抗輸卵管組織纖維化的作用。纖維化是指各種因素引起的組織損傷，如損傷較嚴(yán)重超出實(shí)質(zhì)細(xì)胞的再生修復(fù)能力，則會刺激損傷部位細(xì)胞外基質(zhì)大量積聚及纖維母細(xì)胞過度增殖，導(dǎo)致纖維結(jié)締組織異常沉積，纖維結(jié)締組織增生雖然能夠修復(fù)損傷，但無法具備原來的實(shí)質(zhì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能［13］。因此，抗輸卵管組織纖維化為氣滯血瘀型輸卵管炎性不孕癥治療的重要環(huán)節(jié)。本研究中，全血黏度3/s、血漿黏度、全血黏度30/s隨著種子湯加減方劑量的增加而減少，提示高劑量的種子湯加減方具有改善氣滯血瘀型輸卵管炎性不孕大鼠血流變學(xué)的作用。本研究中，模型組、低劑量組、中劑量組大鼠受孕率較對照組明顯下降，中劑量組、高劑量組大鼠受孕率較模型組明顯升高，提示高劑量種子湯加減方有助于提高氣滯血瘀型輸卵管炎性不孕大鼠妊娠率，改善妊娠結(jié)局。本研究結(jié)果與以往臨床觀察及基礎(chǔ)研究結(jié)論相似，呂勇等［14］發(fā)現(xiàn)，通任種子湯治療氣滯血瘀型盆腔炎性不孕臨床療效肯定，能夠改善患者臨床癥狀與體征，緩解盆腔炎癥程度，提高近期妊娠率。劉麗等［15］亦發(fā)現(xiàn)，中藥能夠改善氣滯血瘀型輸卵管炎性不孕大鼠輸卵管纖維化，并提高其輸卵管組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9、金屬蛋白酶組織抑制因子1水平。丁愛娟等［16］在種子湯治療排卵功能障礙性不孕的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，種子湯能夠改善患者排卵情況并提高6個月內(nèi)妊娠率。

綜上所述，種子湯加減方在治療氣滯血瘀型輸卵管炎性不孕大鼠中，具有改善血流變學(xué)、抗纖維化、助孕的作用。但本研究樣本量小，仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。