劉旭霞 楊志剛劉建飛鞏 媛王茂鶴邸多隆*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,甘肅 蘭州 730000;2.中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所,中國科學(xué)院西北特色植物資源化學(xué)重點實驗室,甘肅省天然藥物重點實驗室,甘肅 蘭州 730000;3.蘭州大學(xué)藥學(xué)院,甘肅蘭州 730000)

枸杞子為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果實[1],是一種藥食兩用中藥材,具有抗氧化、抗阿爾茨海默病、降血糖、抗腫瘤、神經(jīng)保護等多種活性[2-5],由于鮮品含水量、含糖量較高,容易在儲藏過程中發(fā)霉變質(zhì),而干燥可除去其水分,抑制微生物生長,從而延長儲藏時間[6]。文獻報道的干燥方式有自然干燥、熱風(fēng)對流干燥、冷凍干燥、真空干燥、超聲波干燥、膨化干燥、滲透干燥等[7],但不同手段會造成枸杞子化學(xué)成分有所差異,導(dǎo)致其質(zhì)量有差別,曲云卿等[8]印證了這一點。

脫蠟處理是一種損壞蠟質(zhì)層、加快水分排出的方法[9-10],雖然非脫蠟枸杞子外果皮表面依然有蠟質(zhì)層保護,但如果脫蠟過度會導(dǎo)致其內(nèi)部糖分受熱融化,隨著水分遷移至樣品表面,從而影響藥材品質(zhì)[11]。本實驗建立了15 批枸杞子的HPLC 指紋圖譜,考察了自然晾干、設(shè)備干燥(均經(jīng)1% Na2CO3脫蠟處理)、非脫蠟干燥對藥材品質(zhì)的影響,以期為其質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200 型高效液相色譜儀(美國Agilent Technologies 公司),配置G1312A 恒流泵、G1315B 檢測器、G1328B 手動進樣器、Agilent Chemstation software 工作站；AT-950 型柱溫箱(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；KQ-250DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BSA224S-CW 型電子分析天平(萬分之一,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；XQ100 g 型多功能高速粉碎機(上海廣沙工貿(mào)有限公司)；DHG-9140A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；飛鴿牌高速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；SHB-Ⅳ型雙循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

1.2 試劑與藥物 15 批枸杞子均為寧夏中寧產(chǎn)區(qū)種植的寧杞7 號品種,經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)晉玲教授鑒定為寧夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果實,具體見表1。乙腈為色譜純(美國Mreda Technology Inc.)；冰乙酸為色譜純(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；水為純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備 藥材粉碎后過2 號篩。精密稱取3.0 g 粉末于250 mL 錐形瓶中,加15 倍量水,60 ℃下超聲提取30 min,提取液離心(10 000 r/min) 20 min,轉(zhuǎn)移至50 mL 量瓶中加水定容,搖勻,過0.22 μm 微孔濾膜,取續(xù)濾液,即得。

2.2 色譜條件 依利特 Sepherisorb ODS2 色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相0.2%冰乙酸(A) -乙腈(B),梯度洗脫(0～60 min,95%～75%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波 長310 nm；進 樣 量20 μL。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗 取供試品溶液(ND1-1),在“2.2”項色譜條件下進樣測定5 次,以峰面積穩(wěn)定、峰形良好、保留時間適宜的20 號色譜峰為參照峰,計算其余色譜峰相對保留時間RSD 為0.12%～2.08%,相對峰面積RSD 為0.37%～3.68%,表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液(ND1-1),于0、2、4、6、8、24 h 在“2.2” 項色譜條件下進樣測定,測得共有峰相對保留時間RSD 為0.37%～2.35%,相對峰面積RSD 為0.33%～4.66%,表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗 取同一供試品(ND1-1) 5 份,按“2.1” 項下方法制備供試品溶液,在“2.2” 項色譜條件下進樣測定,測得共有峰相對保留時間RSD 為0.02%～1.51%,相對峰面積RSD 為0.96%～4.89%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 HPLC 指紋圖譜建立 稱取15 批藥材粉末,按“2.1” 項下方法制備供試品溶液,在“2.2” 項色譜條件下進樣測定,將上述數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012 版) ”,以ND1-1、ED1-1、W1-1 為參照譜圖,生成不同干燥方式下共有模式,再將其導(dǎo)入相同軟件中,以自然晾干樣品共有模式為參照譜圖,采用平均數(shù)相關(guān)系數(shù)法進行多點校正,時間窗寬度為0.3 s,進行自動匹配,建立共有模式[12],共確定35 個共有峰,見圖1～2。由圖1 可知,不同干燥方式下樣品雖然色譜峰數(shù)量均一致,但其峰面積及峰高存在顯著差異,即其質(zhì)量有所不同。

圖1 不同干燥方式下樣品標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜

圖2 樣品對照指紋圖譜

然后,將上述數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012 版) ” 進行相似度評價,結(jié)果見表2,可知不同批次樣品之間的相似度均大于0.900,說明同一干燥方式下樣品整體一致無差異。再以自然晾干樣品對照指紋圖譜為參照,計算不同干燥方式下的相似度,結(jié)果見表3,可知相似度為0.759～0.997,表明不同干燥方式下樣品成分組成相同,但含有量有差異,其中設(shè)備干燥、自然晾干樣品相似度均大于0.900,而非脫蠟干燥樣品僅為0.759,表明該方式可能會對其質(zhì)量產(chǎn)生影響。

表2 相同干燥方式下相似度測定結(jié)果

表3 不同干燥方式下相似度測定結(jié)果

2.5 化學(xué)計量學(xué)分析

2.5.1 聚類分析 以峰面積穩(wěn)定、峰形良好、保留時間適宜的20 號色譜峰為參照峰,計算其余35 個色譜峰的相對保留時間和相對峰面積,將上述數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件進行聚類分析,采用Ward 法計算樣品之間的分類距離[13],結(jié)果見圖3。由此可知,3 種干燥方式下樣品各自聚為一類,并且自然干燥、設(shè)備干燥樣品又聚為一類,非脫蠟干燥樣品單獨聚為一類,與相似度分析結(jié)果一致。

圖3 樣品聚類分析圖

2.5.2 主成分分析[14]將共有峰相對峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件進行主成分分析,發(fā)現(xiàn)前2 個主成分累積貢獻率達91.4%,能代表大部分特征峰信息,再以前2 個主成分建立坐標(biāo)系得到其得分圖,結(jié)果見圖4。由此可知,樣品按照不同干燥方式呈現(xiàn)明顯的離散,同一干燥方式下可很好地聚到一起,其中設(shè)備干燥、自然干燥樣品離的較近,表明其成分含有量相似；非脫蠟干燥樣品離的較遠,表明其成分含有量與其他兩者差異較大,與相似度分析、聚類分析結(jié)果一致。

圖4 樣品主成分分析得分圖

2.5.3 正交偏最小二乘判別分析[15-17]本實驗以各批樣品共有峰相對峰面積數(shù)據(jù)建立了正交偏最小二乘判別分析模型,其R2Y 為0.992,Q2為0.981,表明模型有較好的預(yù)測效果,再以預(yù)測成分得分值(Tp [1]) 和第1 個正交成分的得分值(To [2]) 繪制得分散點圖,結(jié)果見圖5。由此可知,不同干燥方式樣品在得分散點圖上得到明顯區(qū)分,可視化效果明顯。

2.5.4 置換檢驗 隨機打亂Y 變量的順序200 次,觀察其隨機排列模型與原始變量模型之間的差異,再對兩者R2值、Q2值繪制回歸線,結(jié)果見圖6。由圖可知,R2、Q2回歸線與縱軸的截距分別為0.337、-0.664,右邊原始模型的相關(guān)數(shù)值均大于左邊隨機排列模型的,表明模型無過擬合現(xiàn)象,有效可靠[14]。

圖5 樣品正交偏最小二乘判別分析得分圖

圖6 模型置換檢驗圖

3 討論

本實驗通過HPLC 指紋圖譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法,對不同干燥方式枸杞子進行識別。相似度分析結(jié)果顯示,設(shè)備干燥、自然晾干樣品相似度均大于0.900,而非脫蠟干燥僅為0.759,表明不同干燥方式會對藥材化學(xué)成分有較大影響,其原因可能是未脫蠟樣品表面有蠟質(zhì)層保護,光敏性、熱敏性成分未受到影響,而自然晾干樣品上述2 類成分有一部分被破壞,設(shè)備干燥樣品熱敏性成分亦然[18-19]；聚類分析、主成分分析結(jié)果與相似度分析一致。利用主成分分析可以區(qū)分不同干燥方式的樣品,但是可視化效果不好,通過OPLS-DA 建立樣品識別模型,模型穩(wěn)定可靠,識別率為98.1%,可以很好的鑒別不同干燥方式的樣品。本研究建立了一種不同干燥方式枸杞子的辨別模型,同時也為其他中藥材的鑒別研究提供了新的思路。