樓志華

（江蘇省奧谷生物科技有限公司，江蘇溧陽 213300）

隨著細(xì)菌的研究深入到分子遺傳層面，細(xì)菌RNA聚合酶（RNAP）終止轉(zhuǎn)錄的機(jī)制一直是基因表達(dá)研究的重點(diǎn)。在基因表達(dá)的調(diào)節(jié)中，對轉(zhuǎn)錄終止過程的調(diào)節(jié)是最重要的環(huán)節(jié)之一[1-2]。轉(zhuǎn)錄終止的分子基礎(chǔ)是DNA和蛋白質(zhì)的相互作用，RNA轉(zhuǎn)錄物中形成的特定結(jié)構(gòu)會(huì)使轉(zhuǎn)錄復(fù)合物不穩(wěn)定，目前將這樣造成的轉(zhuǎn)錄終止歸納為兩種機(jī)制：內(nèi)在型和因子依賴型[3]。因此，轉(zhuǎn)錄終止子是和啟動(dòng)子同樣重要的表達(dá)元件。目前，對于啟動(dòng)子鑒定及改造的研究已廣泛開展，而對轉(zhuǎn)錄終止子的認(rèn)識(shí)有限?，F(xiàn)有對細(xì)菌轉(zhuǎn)錄終止子的認(rèn)識(shí)主要來源于對大腸桿菌的研究。芽孢桿菌作為重要的工業(yè)微生物，雖然在生產(chǎn)中已被廣泛使用，但其分子遺傳仍處于起步階段[4-5]。尤其是在轉(zhuǎn)錄終止元件的鑒定方面，目前還鮮有報(bào)道。本研究基于地衣芽孢桿菌基因組信息，預(yù)測并鑒定了不同的轉(zhuǎn)錄終止子。進(jìn)一步通過考察不同終止子對淀粉酶報(bào)告基因表達(dá)的影響對其特性進(jìn)行了評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)中用到的枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis WB600、大腸桿菌Escherichia coli JM109均為本實(shí)驗(yàn)室所保藏。LB培養(yǎng)基、TB培養(yǎng)基均依照文獻(xiàn)配置[1]，重組大腸桿菌培養(yǎng)基中添加100 μg/mL氨芐青霉素，重組芽孢桿菌轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)基中添加20 μg/mL四環(huán)素，枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化用培養(yǎng)基依照文獻(xiàn)配置[2]。

1.2 試劑與儀器

限制性內(nèi)切酶，美國Fermentas公司；T4DNA連接酶、Ex taq DNA連接酶，大連Takara公司；質(zhì)粒提取試劑盒、核苷酸片段純化試劑盒、膠回收試劑盒，Axygen公司；氨芐青霉素、四環(huán)素，生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母粉、蛋白胨，OXOID（美國）公司；其他常用試劑藥品均來自于國藥集團(tuán)（上海）有限公司。

UV2000紫外可見分光光度計(jì)，美國UNICO公司；HB-100恒溫金屬浴，杭州博日科技有限公司；GNP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Delta 320型pH計(jì)，瑞士Mettler-Toledo 公司；Waters 2695高效液相色譜儀，美國沃特斯公司。

1.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增獲得連接六種轉(zhuǎn)錄終止子的目的片段，載體為pHY300并用NruI單酶切。連接體系（20 μL）為：目的片段 14 μL，載體2 μL，T4連接酶 2 μL，Buffer 2 μL。放置16 ℃金屬浴中連接16 h，獲得T1～T6六種重組質(zhì)粒。

1.4 枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化及篩選

枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備方法及篩選方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行[3]。

1.5 重組海藻糖合成酶的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組枯草芽孢桿菌接種于20 mL LB培養(yǎng)基中，在37 ℃、200 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)，以此作為種子液。過夜培養(yǎng)的種子液以3%（V/V）的接種量接種于30 mL TB發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃、250 r/min的條件下培養(yǎng)8 h后，加入終濃度為1.0%（w/w）的30%木糖，于30 ℃、250 r/min的條件下誘導(dǎo)發(fā)酵16 h。對于胞內(nèi)表達(dá)麥芽糖淀粉酶的重組菌，將發(fā)酵液于12 000 r/min、4 ℃條件下冷凍離心收集菌體，收集上清液，上清液即為粗酶液。麥芽糖淀粉酶活力的檢測參照文獻(xiàn)進(jìn)行[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

從NCBI基因數(shù)據(jù)庫中分別預(yù)測得到6種芽孢桿菌來源的不同轉(zhuǎn)錄終止子序列，如表1所示。將構(gòu)建的質(zhì)粒pHY300用NruI單酶切得到載體，構(gòu)建的質(zhì)粒pHY-BLMA分別用6種終止子PCR擴(kuò)增得到目的片段，將PCR產(chǎn)物純化后與載體連接得到重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E. coliJM109，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子接種于液體LB培養(yǎng)基后提取質(zhì)粒，得到了可以表達(dá)淀粉酶基因的重組質(zhì)粒。圖1為PCR擴(kuò)增后得到的目的片段的電泳驗(yàn)證圖，目的片段大小約為2 000 bp。圖2為重組質(zhì)粒導(dǎo)入E. coliJM109中，對長出的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR鑒定的電泳驗(yàn)證圖。

表1 轉(zhuǎn)錄終止子的預(yù)測

圖1 終止子PCR電泳圖

圖2 菌落PCR電泳圖

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)

以野生菌為對照，測定野生菌、原始菌以及重組菌的菌體量、蛋白濃度、粗酶液的酶活，結(jié)果如表2所示。

根據(jù)表2中的重組菌株的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)野生菌沒有酶活，而原始菌以及重組菌均有酶活，說明在原始菌及重組菌內(nèi)都有淀粉酶的表達(dá)。發(fā)酵24 h后野生菌的菌體量最多，而重組菌的菌體量相對于原始菌的較少，但重組菌的蛋白濃度有所提高，酶活有小幅度的增加，單位菌體量上的酶活有較大的提高。由于酶活提高的程度不大而蛋白濃度又有增加，使得單位蛋白的酶活有所降低。重組菌中，生長最好的菌株是B.subtilis WB600（T1）；蛋白濃度最高的是B. subtilis WB600（T6），最高達(dá)到0.885 g/L；酶活力最大的是B. subtilis WB600（T5），最高達(dá)到 161.49 U/mL；單位菌體酶活最高的是B. subtilis WB600（T5），可達(dá)到22.24 U/mL；單位蛋白酶活最高的是B. subtilis WB600（T4），最高達(dá)到306.71 U/mL。

表2 重組菌的表達(dá)

3 結(jié)論

從NCBI數(shù)據(jù)庫中預(yù)測了芽孢桿菌來源的6個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄終止子，以淀粉酶為報(bào)告基因，考察他們對目的基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，所預(yù)測的6個(gè)基因均可以介導(dǎo)目的基因的功能表達(dá)，表明他們具有應(yīng)用為新的表達(dá)元件的潛力。