張博，馬樂，薄曉菲，王雨，孫遠，牛明春

（北京生物制品研究所有限責任公司，北京 100176）

支原體是生物制品細胞培養(yǎng)生產(chǎn)工藝中常見的污染物，2015年版《中華人民共和國藥典》推薦使用支原體肉湯培養(yǎng)基檢測肺炎支原體，精氨酸支原體培養(yǎng)基檢測口腔支原體[1]。市場上檢測肺炎、口腔支原體也是分別使用這兩種培養(yǎng)基。本研究對支原體肉湯培養(yǎng)基在藥典配方的基礎(chǔ)上進行了配方優(yōu)化后，可以替代市場上藥典配方生產(chǎn)的支原體肉湯和精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基，用于同時檢測肺炎、口腔支原體，從而達到用途及培養(yǎng)、檢定的統(tǒng)一性，便于生產(chǎn)、研究等工作。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

肺炎支原體（MP），990420，首都兒科研究所；口腔支原體（MO），ATCC23714，購自美國ATCC；精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基、肺炎支原體肉湯培養(yǎng)基，北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn)。

pH儀雷磁pHS-3D型，上海三信。

1.2 配制培養(yǎng)基

1號培養(yǎng)基：配方優(yōu)化后的新鮮支原體肉湯培養(yǎng)基，成分為硫酸鎂、氯化鎂、牛肉浸粉、酵母浸粉、氯化鈉、葡萄糖、L-精氨酸、酚紅和精氨酸鹽酸鹽。2號培養(yǎng)基：配方優(yōu)化后的干粉支原體肉湯培養(yǎng)基，配方同1號培養(yǎng)基。3號培養(yǎng)基：精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基配方同藥典。4號培養(yǎng)基：肺炎支原體肉湯培養(yǎng)基配方同藥典。其中，1、2、3號培養(yǎng)基接種口腔支原體，1、2、4號培養(yǎng)基接種肺炎支原體。

1.3 培養(yǎng)基合格性鑒定

4種培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后[2]第0 d、7 d、14 d、21 d和28 d，觀察外觀、檢測pH值，每種培養(yǎng)基設(shè)4個重復；在20～25 ℃和30～35 ℃兩個溫度下對4種培養(yǎng)基進行無菌性檢查。

1.4 適用性檢查

1.4.1 菌種的復蘇

將“1.1”中的菌種轉(zhuǎn)種到支原體培養(yǎng)基中，（36±1）℃培養(yǎng)2～3 d觀察復蘇情況或可繼續(xù)復蘇一代。

1.4.2 工作菌株制備

將復蘇的參考菌株轉(zhuǎn)種于支原體培養(yǎng)基中（36±1）℃培養(yǎng) 2～3 d。

1.4.3 菌懸液制備

將“1.4.2”中工作菌株用支原體培養(yǎng)基稀釋，肺炎支原體稀釋到10-7～10-9，口腔支原體稀釋到10-3～10-5，分別接種于4種培養(yǎng)基中。平行試驗3次，每次接種中管各4支。接種之前4種支原體培養(yǎng)基中應按20%的比例加入馬血清。

1.4.4 培養(yǎng)觀察

（36±1）℃培養(yǎng)7～14 d，觀察培養(yǎng)基顏色變化（變紅或變黃）及變色管數(shù)，以判定該培養(yǎng)基的變色單位。支原體培養(yǎng)基變色單位應達到[1]：肺炎支原體10-8、口腔支原體 10-4。

2 結(jié)果與分析

2.1 外觀檢查

如圖1所示，4種培養(yǎng)基在滅菌后0～28 d外觀澄清透明，1號培養(yǎng)基較比其他3種培養(yǎng)基顏色深。

2.2 pH值監(jiān)測

1、2、4號培養(yǎng)基合格pH值為7.4～7.8，3號培養(yǎng)基合格pH值為6.9～7.3。如表1所示，第0 d、7 d、14 d、21 d和28 d，4種培養(yǎng)基在滅菌后pH值全部在合格范圍內(nèi)。

表1 4種培養(yǎng)基pH值變化情況

2.3 無菌性檢查

4種培養(yǎng)基在20～25 ℃和30～35 ℃下培養(yǎng)28 d均無雜菌生長。

2.4 適用性檢查

2.4.1 口腔菌株接種結(jié)果

表2為口腔菌株的接種結(jié)果。用統(tǒng)計學方法進行數(shù)據(jù)處理，發(fā)現(xiàn)在規(guī)定的檢定周期內(nèi)，口腔菌液3個稀釋度接種的優(yōu)化培養(yǎng)基（1號、2號）與藥典配方精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基（3號）陽性管數(shù)差異無顯著意義（χ2=0，P=1.000 0）[3]。

表2 口腔菌株接種結(jié)果

接種口腔支原體菌液的3號、2號、1號培養(yǎng)基陽性靈敏度變色有差異。在第3 d時，稀釋度為10-3的1號、2號培養(yǎng)基已肉眼可見有顏色變化，但無法用影像顯現(xiàn)；第4 d，1號、2號培養(yǎng)基已明顯優(yōu)于3號培養(yǎng)基，且3次平行試驗結(jié)果完全一致。

圖1 培養(yǎng)基外觀檢查

2.4.2 肺炎菌株接種結(jié)果

表3為肺炎菌株的接種結(jié)果。用統(tǒng)計學方法進行數(shù)據(jù)處理，發(fā)現(xiàn)在規(guī)定的檢定周期內(nèi)，肺炎菌液3個稀釋度接種的優(yōu)化配方培養(yǎng)基（1號、2號）與藥典配方支原體肉湯培養(yǎng)基（4號）陽性管數(shù)差異無顯著意義（χ2=0，P=1.000 0）[3]。代藥典配方并應用于口腔支原體和肺炎支原體的同時檢測。

表3 肺炎菌株接種結(jié)果

圖2 肺炎菌株接種實物圖

如圖2所示，為肺炎菌株接種圖，接種肺炎支原體菌液的1號、2號、4號培養(yǎng)基靈敏度無顯著差異。

3 結(jié)論

優(yōu)化配方制備的支原體肉湯培養(yǎng)基從質(zhì)控項目到使用效果與藥典配方制備的肺炎支原體肉湯培養(yǎng)基、精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基結(jié)果無差異，可完全替