羅芳芳，錢(qián)峰，梅芹

（1.上海藥明生物技術(shù)有限公司，上海 200131；2.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438）

DNA免疫于1990年由Wolff等人首次發(fā)現(xiàn)，將編碼蛋白的DNA質(zhì)粒注射入小鼠骨骼肌內(nèi)[1]，在肌肉細(xì)胞內(nèi)表達(dá)基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)，從而奠定了DNA免疫的基礎(chǔ)。通過(guò)DNA免疫技術(shù)，目的基因在體內(nèi)合成蛋白質(zhì)抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)[2]，獲得高親和力抗體。因此DNA免疫技術(shù)應(yīng)用范圍從疫苗研究、醫(yī)學(xué)免疫學(xué)研究擴(kuò)展至單克隆抗體藥物研發(fā)。

雖然DNA免疫有多方面的優(yōu)勢(shì)，但免疫原性弱，免疫周期較長(zhǎng)，因此提高其免疫原性是制備雜交瘤單克隆抗體的關(guān)鍵因素。

本研究選擇大鼠CD138作為測(cè)試蛋白，在血液細(xì)胞中，CD138分子是漿細(xì)胞表面特異性標(biāo)志[3-4]。傳統(tǒng)雜交瘤單克隆抗體是由淋巴、脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生的，但淋巴、脾臟細(xì)胞成分復(fù)雜、細(xì)胞量大，而漿細(xì)胞含量?jī)H占1%～5%[5]，所以特異性CD138抗體對(duì)評(píng)估淋巴和脾臟細(xì)胞中漿細(xì)胞含量特別重要。但尚無(wú)市售的抗大鼠CD138特異性單克隆抗體，而CD138大小鼠種屬同源性高達(dá)90.4%，免疫原性低、動(dòng)物免疫反應(yīng)較弱。

DNA免疫效果是由質(zhì)粒本身、抗原基因、分子佐劑、遞送方式等因素相互作用所決定。本研究通過(guò)對(duì)DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件和分子佐劑進(jìn)行優(yōu)化增強(qiáng)DNA免疫反應(yīng)。通過(guò)將luciferase和大鼠CD138基 因 克 隆 入 pCAGGS-HPRE、pCAGGS-WPRE、pCAGGS-HTLV-1R和pCAGGS-FliC載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒。通過(guò)細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)系統(tǒng)、小鼠動(dòng)物模型對(duì)目的基因體外表達(dá)水平、抗原特異性免疫反應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)比較。

鼠傷寒沙門(mén)菌鞭毛蛋白作為一種新型免疫佐劑，其佐劑效應(yīng)受到科學(xué)家的廣泛關(guān)注。目前，關(guān)于FliC佐劑研究主要是通過(guò)細(xì)菌表達(dá)鞭毛蛋白。本研究將鼠沙門(mén)菌鞭毛蛋白克隆入pCAGGS表達(dá)載體進(jìn)行抗原融合表達(dá)，利用鞭毛蛋白的佐劑效應(yīng)增強(qiáng)DNA免疫原性，從而誘導(dǎo)更強(qiáng)的特異性免疫反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：BALB/C小鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

質(zhì)粒：pCAGGS、pNL3.2.NF-κB-RE[NlucP]由本實(shí)驗(yàn)室保存。

分子實(shí)驗(yàn)試劑：PrimeSTAR Max Premix(2x) DNA聚合酶和DNA分子量Marker購(gòu)于Takara Bio公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)于賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。T4 DNA連接酶購(gòu)于新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室（英國(guó)）有限公司；重組克隆試劑盒購(gòu)于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；瓊脂糖購(gòu)于美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司；DNA回收試劑盒、質(zhì)粒中抽和大抽試劑盒購(gòu)于德國(guó)Macherey Nagel公司；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司。

菌株和細(xì)胞系：F-TOP10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于上海唯地生物技術(shù)有限公司；293F細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

一抗和二抗：小鼠抗大鼠CD138血清由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存，兔抗大鼠CD138多克隆抗體購(gòu)于北京義翹神州科技股份有限公司。HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG二抗購(gòu)于BD公司，PE標(biāo)記羊抗兔IgG購(gòu)于艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，Alexae647標(biāo)記羊抗小鼠IgG購(gòu)于Bethyl Laboratories。

1.2 目的基因擴(kuò)增

1.2.1 Luciferase和大鼠CD138基因PCR擴(kuò)增

以 pNL3.2.NF-κB-RE[NlucP]質(zhì) 粒 為 模 板，luc-F、luc-R為引物，PCR擴(kuò)增出luciferase基因片段。以合成的大鼠CD138基因?yàn)槟０?，CD138-F、CD138-R為引物，PCR擴(kuò)增出大鼠CD138基因片段。

1.2.2 4個(gè)元件PCR擴(kuò)增

以合成的基因?yàn)槟０澹酶髯砸锓謩ePCR擴(kuò)增出WPER、HPRE、HTLV-1R & FliC DNA片段。

1.3 載體的構(gòu)建及鑒定

1.3.1 各元件載體構(gòu)建及鑒定

用XhoⅠ、NheⅠ酶切WPRE和HPRE PCR擴(kuò)增片段、用EcolRⅠ、NotⅠ酶切HTLV-1R PCR擴(kuò)增片段、用XhoⅠ、BglⅡ酶切FliC PCR擴(kuò)增片段，分別克隆入pCAGGS質(zhì)粒中。將轉(zhuǎn)化菌種送到鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測(cè)序驗(yàn)證，并酶切驗(yàn)證。

五是做好流域水功能區(qū)納污紅線考核支撐。從2014年開(kāi)始，國(guó)家對(duì)重要水功能區(qū)進(jìn)行考核。長(zhǎng)江流域水資源保護(hù)局負(fù)責(zé)組織流域水功能區(qū)考核的技術(shù)工作，組織制定流域水功能區(qū)水質(zhì)達(dá)標(biāo)評(píng)價(jià)技術(shù)細(xì)則，每年與地方協(xié)調(diào)制定年度水功能區(qū)考核名錄和監(jiān)測(cè)方案，并對(duì)各省區(qū)監(jiān)測(cè)的水功能區(qū)評(píng)價(jià)結(jié)果進(jìn)行復(fù)核，形成復(fù)核報(bào)告上報(bào)水利部。在最嚴(yán)格水資源管理制度考核中，長(zhǎng)江流域水資源保護(hù)局也按照國(guó)務(wù)院考核組的統(tǒng)一部署，參與部分省區(qū)的考核，并提供長(zhǎng)江流域的水功能區(qū)考核基礎(chǔ)信息，有力的支撐了流域水功能區(qū)納污紅線考核工作[7]。

1.3.2 大鼠CD138和Luciferase表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定

大鼠CD138和Luciferase DNA片段通過(guò)PCR擴(kuò)增，兩端分別引入NotⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。酶切后將其克隆入pCAGGS、pCAGGS-WPRE、pCAGGSHPRE、pCAGGS-HTLV-1R和pCAGGS-FliC，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pCD138、pWCD138、pHCD138、pHTCD138、pFCD138、pluc、pWluc、pHluc、pHTluc。將轉(zhuǎn)化菌種送到鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測(cè)序驗(yàn)證，并用NotⅠ和XhoⅠ分別酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒。

1.4 Luciferase和大鼠CD138基因瞬轉(zhuǎn)表達(dá)檢測(cè)

用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑對(duì)pCD138、pWCD138、pHCD138、pHTCD138、pFCD138、pluc、pWluc、pHluc、pHTluc質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)，設(shè)置2個(gè)重復(fù)孔，未轉(zhuǎn)染293F細(xì)胞為陰性對(duì)照。在37 ℃、5% CO2和200 r/min振蕩速度條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48 h后檢測(cè)大鼠CD138和luciferase表達(dá)水平。

1.5 BALB/C小鼠DNA免疫

用 3個(gè) DNA質(zhì) 粒（pCD138、pHCD138、pFCD138）分別免疫BALB/C小鼠，其中pCD138為對(duì)照組，pHCD138和pFCD138為實(shí)驗(yàn)組，每組4只小鼠。免疫劑量：200 μg/只，免疫途徑：肌肉和皮下注射，每?jī)芍苊庖咭淮巍?/p>

1.6 抗大鼠CD138抗體血清效價(jià)檢測(cè)

用0.5 μg/mL大鼠CD138蛋白包被酶標(biāo)板，4 ℃過(guò)夜。PBST洗滌1次，2%BSA孵育2 h，PBST洗滌3次。小鼠血清以1∶100為起始濃度進(jìn)行3倍稀釋，共11個(gè)稀釋度。將稀釋小鼠血清加入ELISA酶標(biāo)板中，室溫孵育1 h。PBST洗滌3次，加入HPR標(biāo)記羊抗小鼠抗體，室溫孵育1 h。TMB顯色10 min，HCl終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀測(cè)定OD450值。

1.7 抗大鼠CD138雜交瘤單克隆抗體制備與篩選

從pFCD138質(zhì)粒組和對(duì)照組中分別選取一只高抗體效價(jià)BALB/C小鼠，用于雜交瘤單克隆抗體制備。按照標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞電融合操作程序處理淋巴細(xì)胞，并與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行電融合。在HAT篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)融合雜交瘤細(xì)胞，在37 ℃和5% CO2下進(jìn)行定期監(jiān)測(cè)。培養(yǎng)7～10 d后，用ELISA和FACS方法鑒定陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。經(jīng)亞克隆后，篩選出能夠穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤單克隆細(xì)胞。培養(yǎng)7～10 d，收獲細(xì)胞上清液，用Protein A進(jìn)行抗體親和力純化，并評(píng)估抗體特異性。

1.8 抗大鼠CD138單克隆抗體特異性檢測(cè)

抗大鼠CD138抗體以10 μg/mL為起始濃度進(jìn)行5倍稀釋，共12個(gè)稀釋度，用抗大鼠CD138抗體血清效價(jià)相同的方法進(jìn)行ELISA檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因和各元件的PCR擴(kuò)增

以質(zhì)粒pNL3.2.NF-κB-RE[NlucP]為模板，PCR擴(kuò)增出luciferase基因，獲得639 bp DNA片段（圖1）。以合成的大鼠CD138基因?yàn)槟０?，PCR擴(kuò)增出大鼠CD138基因，獲得942 bp片段（圖2）。

以合成的基因?yàn)槟０?，PCR方法擴(kuò)增WPRE、HPRE、HTLV-1R、FliC基因，分別得到598 bp、542 bp、227 bp、1 485 bp DNA片段（圖3）。

圖1 Luciferase PCR擴(kuò)增

圖2 Rat CD138 PCR擴(kuò)增

2.2 質(zhì)粒載體酶切驗(yàn)證

圖3 各個(gè)元件擴(kuò)增

Luciferase和大鼠CD138基因片段分別為663 bp和 942 bp，pCD138、pWCD138、pHCD138、pHTCD138、pFCD138、pluc、pWluc、pHluc、pHTluc、pFluc重組表達(dá)質(zhì)粒分別經(jīng)NotⅠ、XhoⅠ酶切驗(yàn)證（圖4）和測(cè)序驗(yàn)證均完全正確。

WPRE、HPRE、HTLV-1R和Flic基因片段分別為598 bp、574 bp、227 bp和1 485 bp，構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)XhoⅠ和NheⅠ酶切驗(yàn)證和測(cè)序驗(yàn)證均完全正確。

圖4 載體經(jīng)NotⅠ和XhoⅠ酶切鑒定

2.3 大鼠CD138和luciferase基因瞬轉(zhuǎn)表達(dá)分析

如圖5 Luciferase瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)結(jié)果表明：pluc質(zhì)粒為對(duì)照組，其Luciferase平均活性為789250 RLU。與對(duì)照組相比，含HPRE元件pHluc質(zhì)粒顯著地提高Luciferase表達(dá)水平（P＜0.05）；pWluc、pHTluc質(zhì)粒luciferase表達(dá)水平無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

圖5 3個(gè)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件對(duì)luciferase表達(dá)水平的影響

如圖6大鼠CD138瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)檢測(cè)結(jié)果表明：與對(duì)照組pCD138質(zhì)粒相比，含HPRE元件pHCD138質(zhì)粒大鼠CD138表達(dá)水平相似，無(wú)顯著差異（P＞0.05）；pWCD138、pHTCD138質(zhì)粒大鼠CD138表達(dá)降低，但無(wú)顯著差異（P＞0.05）；pFCD138質(zhì)粒大鼠CD138表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。

2.4 抗大鼠CD138特異性血清效價(jià)檢測(cè)

如圖7小鼠血清效價(jià)結(jié)果表明：與對(duì)照組（pCD138）相比，pFCD138質(zhì)粒明顯提高 BALB/C小鼠的動(dòng)物免疫反應(yīng)，其他質(zhì)粒相對(duì)較弱；而且pFCD138質(zhì)粒組動(dòng)物免疫反應(yīng)更快，明顯縮短免疫周期。

圖6 4個(gè)元件對(duì)大鼠CD138表達(dá)的影響

圖7 大鼠CD138特異性血清效價(jià)總結(jié)

2.5 抗大鼠CD138雜交瘤單克隆抗體制備與篩選

用ELISA和FACS方法鑒定陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，獲得5株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞：1株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞（clone 8-C2）來(lái)自對(duì)照組質(zhì)粒，4株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞（clone 35-G11、39-D2、42-G8和 44-A9） 來(lái) 自 pFCD138質(zhì)粒組。經(jīng)過(guò)亞克隆，最終獲得4個(gè)陽(yáng)性雜交瘤單克隆細(xì)胞（clone 8-C2、35-G11、39-D2和44-A9）。

2.6 抗大鼠CD138純化單克隆抗體評(píng)估與鑒定

圖8所示，從pFCD138質(zhì)粒獲得35-G11和39-D2兩株單克隆抗體均與大鼠CD138特異性結(jié)合，而且具有高親和力。35-G11抗體ELISA EC50 0.03 μg/mL，F(xiàn)ACS EC50 0.33 μg/mL；39-D2 抗 體ELISA EC50 0.03 μg/mL，F(xiàn)ACS EC50 0.39 μg/mL。但8-C2和44-A9抗體與大鼠CD138結(jié)合力弱，均無(wú)法計(jì)算EC50。其中8-C2抗體來(lái)自pCD138質(zhì)粒免疫、44-A9抗體來(lái)自pFCD138質(zhì)粒免疫。

鞭毛蛋白FliC作為一種新型分子佐劑，通過(guò)TLR5介導(dǎo)多種信號(hào)通路的免疫刺激反應(yīng)。鞭毛蛋白以多種形式佐劑誘導(dǎo)強(qiáng)烈先天性免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，因此鞭毛蛋白具有非常廣泛的適應(yīng)性[7]。鞭毛蛋白作為免疫佐劑具有很多優(yōu)越性：（1）鞭毛蛋白對(duì)宿主不會(huì)產(chǎn)生超敏反應(yīng)；（2）活化抗原呈遞細(xì)胞的功能顯著，且可同時(shí)增強(qiáng)抗原呈遞細(xì)胞對(duì)外來(lái)抗原的攝取、加工和遞呈功能。本研究表明將鞭毛蛋白克隆入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，與抗原基因融合表達(dá)，不僅顯著增強(qiáng)小鼠特異性免疫反應(yīng)，而且獲得更多高質(zhì)量的特異性抗體。

3 結(jié)論

HPRE質(zhì)粒能顯著增強(qiáng)luciferase表達(dá)水平，WPRE、HTLV-1R元件對(duì)目的基因表達(dá)無(wú)增強(qiáng)作用。FliC質(zhì)粒會(huì)降低大鼠CD138表達(dá)，與預(yù)期結(jié)果相符。因?yàn)镕liC作為免疫佐劑，并不具有調(diào)控基因表達(dá)的作用，但與抗原基因融合表達(dá)，大分子量蛋白質(zhì)會(huì)影響其表達(dá)量。最終選擇HPRE元件及FliC質(zhì)粒進(jìn)行小鼠免疫反應(yīng)效果評(píng)價(jià)。FliC質(zhì)粒顯著提高 BALB/C小鼠免疫反應(yīng)，而且動(dòng)物免疫反應(yīng)更快，明顯縮短免疫周期。HPRE反而會(huì)降低動(dòng)物免疫反應(yīng)，可能是HPRE與pCAGGS質(zhì)粒AG內(nèi)含子并沒(méi)有協(xié)同作用。FliC作為新型分子佐劑，與抗原基因融合表達(dá)，能共同激活抗原呈遞細(xì)胞，促進(jìn)抗原在細(xì)胞內(nèi)提呈、加工，誘導(dǎo)促炎癥性因子以及細(xì)胞因子的分泌，從而激活T細(xì)胞和B細(xì)胞應(yīng)答。與對(duì)照組（pCD138質(zhì)粒）相比，含F(xiàn)liC質(zhì)粒獲得35-G11和39-D2雜交瘤單克隆抗體具有更高的親和力。

圖8 大鼠CD138抗體特異性結(jié)合鑒定