丁小　趙云龍　李艷嬌　喬淑芬　許夢瑤　苗婷婷

摘要：為探索花鰍對溫度的急性應激反應，采用8℃、12℃、16℃和20℃脅迫長期養(yǎng)殖于12±2℃的溫度條件下的花鰍12小時、24小時和48小時，觀察行為、成活率，超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和丙二醛指標。結果顯示，4個溫度梯度下，成活率均為100%，行為發(fā)生變化，溫度越高活動性越強，20℃開始出現(xiàn)在水體中上層頻繁游動現(xiàn)象。同一溫度處理，除12℃處理組，超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性和丙二醛含量均隨時間延長呈先上升后下降的趨勢，不同時間存在顯著差異;同一檢測時間，三者均隨溫度升高呈先下降后上升的趨勢，除48小時的不同溫度超氧化物歧化酶活性之間無顯著差異，其余不同溫度均存在顯著差異。水溫發(fā)生急劇變化，影響魚體行為，產生氧化應激反應。在實際養(yǎng)殖生產中，應密切關注養(yǎng)殖水溫的變化，減少溫度應激，增加花鰍免疫力，提高抗病能力。

關鍵詞：花鰍;溫度;超氧化物歧化酶;過氧化氫酶;丙二醛

中圖分類號：Q955? ? ? ? 文獻標識碼：A

花鰍（Cobitis taenia）屬鰍科動物，是多年生小型經濟冷水魚，也是一味中藥材，長白山區(qū)冷水域有分布，對水體環(huán)境要求極高，生活在清澈的砂石底溪水或河流中[1]，明顯不同于常見泥鰍。魚類在進化過程中對外界剌激形成了應激反應。如果刺激超出了魚類正常的調控范圍，則會對健康產生危害。受養(yǎng)殖環(huán)境約束，當魚無法逃避又不能克服這些有害刺激時，對魚的危害就更加突出。因為應激能力會使魚類重新分配體內能量，以應對眼前危機，進而將不可避免地削弱生長、繁殖和免疫等方面的機能，即為應激付出一定的生物學代價[2]。本文從溫度刺激方面入手，探究花鰍應激反應，并尋找緩解其應激的措施，以期為花鰍及其他長白山區(qū)冷水魚的人工馴養(yǎng)和繁殖等活動提供理論依據和實踐基礎，同時豐富魚類應激生物學。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料與飼養(yǎng)管理

試驗在通化師范學院長白山區(qū)冷水魚類分子進化與健康養(yǎng)殖試驗室進行，材料于2020年06月初取自通化育華農林科技發(fā)展有限責任公司。共計450條外觀無異常、健康、初始重量為8.71±0.50 g、體長為101.74±1.70 mm的花鰍作為研究對象，置于養(yǎng)殖水族箱（聚乙烯塑料，長寬高分別為1.5 m、1.0 m、0.8 m），飼養(yǎng)條件為水溫12±1℃，pH值7.0～7.5，溶解氧含量大于5.0 mg/L，氨氮含量小于0.01 mg/L，硫化物小于0.05 mg/L，穩(wěn)定飼養(yǎng)2周后，開始試驗。試驗期間，每天準確稱取一定量的飼料，依據每日殘餌量調整次日投喂量，投喂后1小時，將殘餌用虹吸管吸出。投喂時間分別為每天早、晚6：00。養(yǎng)殖用水先經曝氣，每周換水1次。

1.2? 試驗方法與操作步驟

試驗設置4個溫度處理組（8℃、12℃、16℃和20℃），每個溫度設置3個重復組，采用自動控溫設備控制溫度。試驗開始隨機取30尾放入設定溫度的水族箱中，在0小時、12小時、24小時和48小時取樣，每個時間點每箱隨機取樣5尾魚，試驗期間不飼喂。

1.3? 樣品采集及測定

取5尾魚后解剖取肝胰臟，用吸水紙將肝胰臟擦干，精準稱取組織，冰浴條件下，按體積（mL）∶質量（g）=9∶1的比例加入生理鹽水，使用玻璃研磨器磨碎后裝進離心管，2500 r/min，4℃條件下，離心10 min取上清液檢測。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）試劑盒，購自南京建成生物研究所，操作按照說明書執(zhí)行。

1.4? 數據處理

試驗所得數據均用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），采用Duncan法進行多重比較。數據均以平均數±標準差進行表示。

2? 結果與分析

2.1? 急性溫度脅迫對花鰍生存和行為影響

如表1所示，所選擇的4個溫度3個時間點，花鰍成活率均為100%，無死亡，行為發(fā)生了變化，雖都會在底層聚集，但溫度越低活動性減弱，溫度越高活動性加強，20℃開始出現(xiàn)在中上層頻繁游動現(xiàn)象。

2.2? 急性溫度脅迫對花鰍肝胰臟SOD和CAT活性的影響

如圖1所示，同一溫度處理，SOD活性隨時間延長呈先上升后下降的趨勢，除12℃，不同時間SOD活性之間存在顯著差異（P<0.05）;同一檢測時間，除起始0小時，SOD活性隨溫度升高呈先下降后上升的趨勢，12小時和24小時的不同溫度SOD活性之間存在顯著差異（P<0.05），48小時的不同溫度SOD活性之間無顯著差異。

如圖2所示，同一溫度處理，CAT活性隨時間延長呈先上升后下降的趨勢，除12℃，不同時間CAT活性之間存在顯著差異（P<0.05）;同一檢測時間，除起始0小時，CAT活性隨溫度升高呈先下降后上升的趨勢，不同溫度CAT活性之間存在顯著差異（P<0.05）。

2.3? 急性溫度脅迫對花鰍肝胰臟MDA含量的影響

如圖3所示，同一溫度處理，除12℃，MDA含量均隨時間延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，不同時間MDA含量之間存在顯著差異（P<0.05）;同一檢測時間，除起始0小時，MDA含量均隨溫度升高呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，不同溫度MDA含量之間存在顯著差異（P<0.05）。

3? 討論

溫度是影響動物生長發(fā)育最重要的因素之一。急性溫度變化是魚類在養(yǎng)殖生產、商品運輸甚至自然生活過程中可能遭遇到的最常見脅迫，可造成機體代謝紊亂，使體內自由基大量積累，進而損害細胞和組織正常的生理機能和免疫防御能力[3]。魚類會通過調節(jié)代謝、離子平衡以應對溫度變化，保持相對穩(wěn)定的平衡狀態(tài)，減少自身受到傷害。魚類具有認知或感知能力[4]，行為變化是遭受刺激后最直接、快速的反應[5]。與生理指標的檢測方法相比，具有簡易、便捷、實用等優(yōu)勢。由試驗可知，在急性溫度脅迫下，成活率雖均為100%（表1），但20℃開始出現(xiàn)中上層頻繁游動現(xiàn)象。由此可見，相對高溫急性脅迫，花鰍對于低溫脅迫適應能力要更強一些，這也進一步證實了花鰍屬于典型的冷水魚。

水溫急劇變化，魚類會通過連續(xù)的生化反應和內分泌系統(tǒng)調節(jié)自身的代謝水平來適應。細胞水平上最常見是氧化應激反應，以酶抗氧化系統(tǒng)[6]（如SOD、CAT等）和過氧化脂質及其產物MDA[7，8]等作為量化指標。溫度脅迫花鰍時，氧化還原產生活性氧自由基，導致體內活性氧代謝失衡，不及時清理，就會造成機體活性氧傷害[9]。SOD和CAT是生物體內2種相互關聯(lián)的抗氧化酶，可聯(lián)合清除活性氧自由基，免受氧化傷害，體內SOD和CAT的酶活力下降，標志著機體清除自由基的能力下降。檢測SOD和CAT的動態(tài)變化，可以準確地反映機體內自由基的代謝及組織的氧化損傷情況，對判斷健康狀況及免疫防御能力具有重要的參考價值[10]。本研究中，花鰍遇到溫度脅迫后，SOD酶活性迅速升高，用于清除體內的活性氧自由基等。雖然CAT活性變化的幅度與SOD相差不大，但CAT活性的變化有明顯的滯后性，直至24小時時才達到最大值，而此時SOD已呈下降趨勢，說明花鰍的SOD酶活性較CAT更易受環(huán)境因子的影響。

MDA是細胞膜脂過氧化作用的產物，產生會加劇膜的損傷。在機體衰老生理和抗性生理研究中，MDA含量是一個常用指標[11]。MDA產生量的多少能夠代表膜脂過氧化的程度，也可間接反映組織的抗氧化能力的強弱。一般來說，MDA含量越高，生物體所受的壓力越大。半滑舌鰨在低溫脅迫6小時后，MDA就會明顯的升高[12]。本研究中，MDA含量從脅迫12小時開始就有升高的現(xiàn)象，至24小時達到最高值，48小時后即出現(xiàn)了下降的趨勢。這一變化規(guī)律與溫度脅迫凡納濱對蝦[13]和福壽螺[14]的MDA含量變化結果類似。表明溫度刺激后，魚體代謝加快，脂質過氧化程度增強，通過一段時間調節(jié)體內抗氧化酶活性，可以使體內脂質過氧化程度降低，適應溫度變化。

取樣期正好是花鰍的繁殖季節(jié)，水溫可能發(fā)生急劇變化，影響機體細胞和組織正常的生理機能和免疫能力。由于機體各層次的代謝水平和生理狀況都發(fā)生了相應變化，不同因子間是相互貫通、相互依存、不可分割，共同維護機體內環(huán)境的相對穩(wěn)定，進而會對處于繁殖期的親魚產生影響，影響種群的補充。在實際養(yǎng)殖生產中，對于進入生殖期的雌魚，更應密切關注養(yǎng)殖水溫的變化，減少溫度應激，增加魚體免疫力，提高抗病能力。

參考文獻

[1]富國棟，高文由. 長白山西南坡野生經濟動物志[M]. 吉林：通化地區(qū)農業(yè)區(qū)劃委員會辦公室，1985，39.

[2]Moberg G， Mench J. The Biology of Animal Stress： Basic Principles and Implications for Animal Welfare[M]. New York： CABI，2000，1-377.

[3]Orbea A， Ortiz-Zarragoitia M， Solé M et al. Antioxidant enzymes and peroxisome proliferation in relation to contaminant body burdens of PAHs and PCBs in bivalve molluscs， crabs and fish from the Urdaibai and Plentzia estuaries （Bay of Biscay）[J]. Aquatic Toxicology，2002，58（1）：75-98.

[4]Volpato G. Challenges in assessing fish welfare[J]. ILAR J，2009，50（4）：329-337.

[5]Brown C， Laland K， Krause J. Fish Cognition and Behavior[M]. 2011，1-450.

[6]Pandey S， Parvez S， Sayeed I， et al. Biomarkers of oxidative stress： a comparative study of river Yamuna fish Wallago attu （Bl. & Schn.）[J]. The Science of the Total Environment，2003，309（1-3）：105-115.

[7]Morales AE， Pérez-Jiménez A， Hidalgo MC et al. Oxidative stress and antioxidant defenses after prolonged starvation in Dentex dentex liver[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C Toxicology & Pharmacology，2004，139（1-3）：153-161.

[8]Prieto AI， Pichardo S， Jos á et al. Time-dependent oxidative stress responses after acute exposure to toxic cyanobacterial cells containing microcystins in tilapia fish （Oreochromis niloticus） under laboratory conditions[J]. Aquatic Toxicology，2007，84（3）：337-345.

[9]王偉，姜志強，孟凡平，等. 急性溫度脅迫對太平洋鱈仔稚魚成活率、生理生化指標的影響[J]. 水產科學，2012，31（8）：463-466.

[10]洪美玲，陳立僑，顧順樟，等. 不同溫度脅迫方式對中華絨螯蟹免疫化學指標的影響[J].應用與環(huán)境生物學報，2007，13（6）：818-822.

[11]Lepage G， Munoz G， Champagne J， et al. Preparative steps necessary for the accurate measurement of malondialdehyde by high-performance liquid chromatography. Analytical Biochemistry，1991，197（2）：277-283.

[12]孫學亮，邢克智，陳成勛，等.急性溫度脅迫對半滑舌鰨血液指標的影響[J]. 水產科學，2010，29（7）：387-392.

[13]Xu Z， Regenstein J M， Xie D， et al. The oxidative stress and antioxidant responses of Litopenaeus vannamei to low temperature and air exposure. Fish & Shellfish Immunology，2018，72：564–571.

[14]陳煉，鄔婷，陳燏，等. 溫度對福壽螺抗氧化酶活性和丙二醛含量的影響[J]. 動物學雜志，2019，54（5）：727-735.

基金項目：吉林省科技發(fā)展計劃項目（20190301050NY）;通化師范學院校級項目（CS2020092）。

作者簡介：丁?。?001-），女，山東莒縣人，本科，生物科學專業(yè)。

通信作者：趙云龍（1983-），男，北京人，博士研究生，研究方向：動物資源研究與利用。E-mail：252268020@qq.com