宋居杰 寧思思 溫圓圓 秦雪

摘要：目的 探討多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（MLPA）聯(lián)合羊水染色體核型分析在產(chǎn)前檢測中的應(yīng)用價(jià)值。方法 同時(shí)采用MLPA及染色體核型分析技術(shù)對4269例羊水進(jìn)行非整倍體檢測。結(jié)果 兩種方法共檢出102例非整倍體，包含嵌合型非整倍體19例，在MLPA的提示下染色體核型分析額外檢出1例低比例嵌合體，除9例嵌合體僅在核型分析檢出外，其余結(jié)果基本一致，故兩種方法檢測結(jié)果的符合率為99.79%。結(jié)論 MLPA非整倍體技術(shù)聯(lián)合羊水染色體核型分析應(yīng)用于非整倍體的產(chǎn)前檢測，可顯著縮短非整倍體的診斷周期，提高嵌合型非整倍體的檢出率。

關(guān)鍵詞：MLPA;非整倍體;核型分析;產(chǎn)前診斷;嵌合體

【中圖分類號】R4 ?【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A ?【文章編號】1673-9026（2021）14--01

非整倍體是染色體數(shù)目異常的一種，即染色體數(shù)目的減少或者增加，主要包含單體綜合征、三體綜合征、嵌合體等[1]。臨床上的染色體非整倍體最常見于13、18、21、X和Y這5條染色體，約占產(chǎn)前診斷中有臨床意義的染色體異常的86%[2] 。染色體非整倍體異常發(fā)生于胎兒細(xì)胞可導(dǎo)致流產(chǎn)或出生缺陷[3]。染色體病目前并沒有很好的治療方法，對家庭和社會(huì)都帶來巨大的負(fù)擔(dān)，因而在產(chǎn)前診斷胎兒染色體非整倍體異常降低出生缺陷顯得尤為重要。MLPA技術(shù)是由 schouten 等[4]在2002年首先報(bào)道的，該技術(shù)高效、特異，在單管里可一次性完成至少40個(gè)核苷酸序列的檢測，主要針對大片段的缺失和重復(fù)突變，可用于染色體非整倍體的快速產(chǎn)前診斷。本研究主要探討MLPA 非整倍體檢測技術(shù)在常見染色體非整倍體中的應(yīng)用價(jià)值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2017年1月至2020年12月在玉林市婦幼保健院優(yōu)生遺傳科進(jìn)行產(chǎn)前優(yōu)生遺傳咨詢的4269例符合產(chǎn)前診斷指征的孕婦，年齡 18-47 歲，孕周17-27w。在充分知情告知并簽署產(chǎn)前診斷知情同意書后進(jìn)行羊膜腔穿刺并獲取羊水樣本20ml， 并分裝到3支15ml無菌離心管中，每支管6～8ml，其中2支用于細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行染色體核型分析，另1支用于MLPA檢測。

1.2 方法

1.2.1 染色體核型分析

羊水標(biāo)本離心后棄上清，留約0.5 ml，加入4ml羊水培養(yǎng)基混勻后接種。選擇適宜時(shí)機(jī)行本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)細(xì)胞收集、低滲、固定、滴片、G顯帶及吉姆薩染色等處理。按人類細(xì)胞基因組學(xué)國際命名體系（ISCN）2016 版描述核型。

1.2.2 MLPA方法

按照本實(shí)驗(yàn)室羊水細(xì)胞DNA提取、PCR擴(kuò)增、毛細(xì)管電泳和結(jié)果分析等常規(guī)步驟進(jìn)行。

2 結(jié)果

在4269例樣本中，4167例兩種方法均未檢測出染色體非整倍體異常。在檢出的102例常見染色體非整倍體異常樣本中，兩種方法共同檢出93例常見非整倍體異常，染色體核型分析比MLPA多檢出9例異嵌合型常見染色體非整倍體，總體符合率99.79%（4260/4269），102例異常結(jié)果分布情況見表1。

3 討論

產(chǎn)前診斷染色體異常的傳統(tǒng)方法是進(jìn)行胎兒染色體核型分析[5]，核型分析也是診斷染色體非整倍體的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法檢測周期長、操作繁瑣、要求較高的操作技術(shù)，影響因素多，且最終的培養(yǎng)結(jié)果有時(shí)不一定能夠達(dá)到核型分析的要求從而能導(dǎo)致核型判讀失敗[6]。因此，臨床工作中迫切需要新的診斷技術(shù)來彌補(bǔ)染色體核型分析的缺陷[7]。MLPA是目前已報(bào)道的快速產(chǎn)前診斷技術(shù)之一，具有高通量、檢測時(shí)間短（可在收到標(biāo)本 24-48h 后出結(jié)果），特異性好，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

本研究中，羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型分析成功率100%，MLPA檢測成功率100%，兩種方法均能在行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定期限內(nèi)得到結(jié)果。MLPA可在接收標(biāo)本48h內(nèi)得到結(jié)果，核型分析則需要20d，兩者聯(lián)合檢測，可以對MLPA方法提示異常的病例優(yōu)先進(jìn)行核型分析，最快能在2W左右得到核型分析的結(jié)果，大大提高了產(chǎn)前診斷的效率。

4269例樣本的檢測結(jié)果中，MLPA技術(shù)檢出常見染色體（21、18、13、X和Y染色體）非整倍體93例，結(jié)果均與核型分析一致，4167例未見異常，核型分析也未檢出常見（21、18、13、X和Y染色體）非整倍體，有9例嵌合體是核型分析發(fā)現(xiàn)，而MLPA未見異常，故兩種方法的結(jié)果符合率達(dá)到99.79%（4260/4269），與覃宋強(qiáng)等[8]報(bào)道的一致。其中MLPA檢出1例18號長臂的等臂異常，有了MLPA結(jié)果的驗(yàn)證，染色體核型分析可以直接出具準(zhǔn)確的結(jié)果，可見該技術(shù)對相關(guān)染色體的非平衡性結(jié)構(gòu)異常也具有提示作用。

MLPA非整倍體檢測技術(shù)在染色體嵌合體中的應(yīng)用。染色體嵌合體，即兩個(gè)或兩個(gè)以上不同細(xì)胞系同時(shí)存在于同一個(gè)體，在人類囊胚植入前后普遍存在，可能導(dǎo)致遺傳異常、流產(chǎn)、死產(chǎn)[9]。在本研究中，染色體核型分析共檢測出19例嵌合體，MLPA檢出其中的10例（52.6%）。其中7例嵌合體兩種方法的結(jié)果是一致的，3例染色體核型分析結(jié)果為性染色體嵌合體，MLPA結(jié)果提示為純合體，結(jié)果有所差異，其中1例染色體核型分析的結(jié)果為45，X[65]/46，X，+mar[35]，MLPA結(jié)果提示為45，X，可能是因?yàn)閙ar染色體并未攜帶基因，或者攜帶的基因不在MLPA的檢測范圍，由于45，X占大多數(shù)，遺傳咨詢可按特納綜合征進(jìn)行;1例染色體核型分析的結(jié)果為45，X[48]/46，X，del（X）（p22.1）[41]，MLPA結(jié)果提示為45，X，可能是嵌合比例失真所致;1例染色體核型分析的結(jié)果為45，X[9]/47，XYY[42]，MLPA結(jié)果提示為47，XYY，嵌合比例較低，MLPA未能提示嵌合。Koope 等[10]研究認(rèn)為 MLPA 能夠檢測出異常核型比例高于 20% 的嵌合體，本次研究MLPA檢出2例嵌合比例低于20%，其中1例嵌合比例只有5.7%，這個(gè)病例是在MLPA提示異常的情況下進(jìn)行了加大計(jì)數(shù)分析，如果沒有MLPA結(jié)果的提示，很可能會(huì)漏診，給臨床帶來不夠準(zhǔn)確的產(chǎn)前診斷結(jié)果。在MLPA未能準(zhǔn)確提示的9例嵌合體中，僅有1例染色體核型分析結(jié)果嵌合比例>20%（22.2%），可能是由于羊水細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)，出現(xiàn)優(yōu)勢生長，導(dǎo)致嵌合比例不真實(shí)。本次研究MLPA結(jié)果均在染色體核型結(jié)果之前得出，可以給核型分析工作提供更多的信息，提高嵌合體檢出率。

綜述所述，MLPA檢測方法操作簡單、周期短、結(jié)果準(zhǔn)確，聯(lián)合染色體核型分析應(yīng)用于常見染色體非整倍體的快速產(chǎn)前檢測，可大幅提高產(chǎn)前診斷效率，同時(shí)還可以提高染色體嵌合體的檢出率，為臨床遺傳咨詢提供更準(zhǔn)確的診斷依據(jù)，對降低出生缺陷有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]鄧璐，孫筱放，張慧敏，等.MLPA快速診斷胎兒染色體非整倍體疾病方法的研究與應(yīng)用[J].分子診斷與治療雜志，2011，5：312-317.

[2]周君，朱慶文，徐愛萍，等.MLPA聯(lián)合染色體核型分析在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用探討[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2015，10：49-50+22.

[3]Yakut S，Toru HS，Cetin Z，et al.Chromosome abnormalities identified in 457 spontaneous abortions and their histopathological findings[J].Turk Patoloji Derg，2015，31（2）：111-118.

[4] Schouten JP，McElgunn CJ，Waaijer R，et a1.Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligationdependent probe amplification[J].Nucleic Acids Res，2002，30（12）：57-69.

[5]林少賓，羅艷敏，吳堅(jiān)柱，等.兩例Miller-Dieker綜合征胎兒的產(chǎn)前遺傳學(xué)分析[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2017，34（1）：89-92.

[6]Slater H R，Bruno D L，Ren H，et al.Rapid，high throughput prenatal detection of aneuploidy using a novel quantitative method（MLPA）[J].J Med Genet，2003，40（12）：907-912.

[7]張建林，王珊珊，夏艷，等.染色體同步化與熒光原位雜交技術(shù)在核型分析中的聯(lián)合應(yīng)用[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2015，32（6）：894-895.

[8]覃宋強(qiáng)，徐玉嬋，韋小妮，等.MLPA 技術(shù)聯(lián)合染色體核型分析在羊水染色體非整倍體產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2020，28（2）：157-160.

[9]Taylor TH，Gitlin SA，Patrick JL，et al.The origin，mechanisms，incidence and clinical consequences of chromosomal mosaicism in humans[J].Hum Reprod Update，2014，20 （4）：571-581

[10] Kooper AJ，F(xiàn)aas BH，F(xiàn)eenstra I，et al.Best diagnostic approach for the genetic evaluation of fetuses after intrauterine death in first，second or third trimester：QF-PCR，karyotyping and/or genome wide SNP array analysis[J].Mol Cytogenet，2014，7（1）：6.