魏 歆， 林芳明，雷生妍， 張紅見，賈彩惠， 葛麗萍， 趙 靜

(1.青海大學農(nóng)牧學院， 青海西寧810016 ； 2.青海省食品檢驗檢測院， 青海西寧810008 ； 3. 陜西省畜牧技術(shù)推廣總站， 陜西西安710016)

金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒是一個全球性問題，對食品安全和人類健康造成重大威脅。當食品被金黃色葡萄球菌污染后，會分泌如金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal enterotoxins，SE)、耐熱核酸酶(nuc)等各種毒素，大大增加了其侵襲性和致病力。據(jù)報道[1]，全球由金黃色葡萄球菌5種腸毒素SEA～SEE引起的食物中毒的比例高達95%，而nuc的致病性與SE的相關(guān)性達到95%，可作為是否是金黃色葡萄球菌引起的食物中毒的指標。金黃色葡萄球菌因菌株的來源不同，其分泌的腸毒素及耐熱核酸酶的類型也各異，即使分泌同一種腸毒素或耐熱核酸酶，其產(chǎn)生量往往也會因生長環(huán)境不同而有差異[2]，給因金黃色葡萄球菌引起的食物中毒的預防及流行控制帶來很大難度，一直以來也都是食源性污染監(jiān)測的重點對象。目前有大量的SE基因分型和食源性疾病的研究[3-4]，但涉及SE及nuc表達規(guī)律的研究卻鮮有報道。本試驗利用RT-qPCR在mRNA水平對西寧市不同區(qū)域食品中檢出率最高的SEA、SEB、SEE三種SE及nuc基因在不同生長階段的表達模式，二者之間的相關(guān)性進行研究，以期為金黃色葡萄球菌污染的防控以及食品安全監(jiān)控和風險評估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集 按照食品微生物檢驗采樣的要求，于2017年8月—2018年3月分別從西寧市的集貿(mào)市場、超市、路邊攤點采集牛乳類(生鮮牛乳、包裝牛乳)；豬肉制品(香腸)；果蔬類(橙子；豆角、蘑菇、西紅柿、豆腐、茄子、黃瓜、胡蘿卜、西蘭花、青菜)；肉類(雞腿、雞爪、雞翅、羊肉、豬肉、牛肉)；海鮮類(魚、蝦)，共計169份。

1.2 菌株來源 試驗菌株為通過革蘭染色、鏡檢、生化試驗以及PCR，從169份樣品中分離鑒定得到的121株金黃色葡萄球菌。

1.3 主要試劑培養(yǎng)基及試劑 TSB培養(yǎng)基，購自北京康為世紀生物科技有限公司；SYBR PremixExTaq試劑盒，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、細菌總RNA 提取試劑盒，均購自TaKaRa有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 3株金黃色葡萄球菌菌株SAn5、SAxj、SAn2生長曲線測定 根據(jù)分離的121株菌株和利用PCR對檢測出的SEA、SEB、SEE三種SE基因，分別以SAn5、SAxj、SAn2作為目標菌株測定生長曲線。各目標菌株接種及OD值的測定見參考文獻[5]。

1.4.2 金黃色葡萄球菌總RNA提取及檢測 按細菌RNA試劑盒操作說明書進行，提取的RNA進行2%瓊脂糖凝膠電泳并觀察，利用微量核酸蛋白檢測儀檢測其濃度和純度。

1.4.3 反轉(zhuǎn)錄-熒光定量PCR(RT-qPCR)

1.4.3.1 引物設(shè)計 參考于宏偉等[5]文獻設(shè)計nuc基因、內(nèi)參(16S rRNA)基因及SEA、SEB、SEE三個腸毒素基因的特異性引物，由西安擎科澤西生物科技有限責任公司合成，見表1。

1.4.3.2 RT-qPCR 以細菌總RNA為模板，用試劑盒合成cDNA，進行RT-qPCR反應，各目標基因做3個平行。反應體系為：正、反向引物各0.5 μL，SYBR PremixExTaq10.0 μL，cDNA模板1.0 μL，RNase free dH2O 8.0 μL，總體積20.0 μL。反應條件：94 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，58 ℃退火延伸15 s，共45個循環(huán)。反應結(jié)束后，獲取Ct值及相關(guān)曲線。

1.5 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)Ct值，采用2-△△Ct法計算各目標基因在不同時期的相對表達量。獲取檢測樣本和內(nèi)參基因的Ct值，二者差異為△Ct，檢測樣本△Ct和對照樣本的差異為△△Ct；倍數(shù)差異=2-△△Ct。結(jié)果以一株菌的目標基因在某時期的表達對于其遲緩期的相對表達量為校準樣本，利用SPSS軟件進行分析。

表1 金黃色葡萄球菌腸毒素基因、耐熱核酸酶及內(nèi)參基因引物Table 1 The primers of SE,nuc and 16S rRNA gene

2 結(jié)果

2.1 SAn5、SAxj、SAn2三株菌生長曲線測定 選擇含有SEA、SEB、SEE基因的3株目標菌株接種后，前10 h每隔1 h取樣，之后每隔2 h取樣，直至16 h；以培養(yǎng)時間(h)、OD600吸光度值作為橫縱坐標，繪制生長曲線，見圖1。

3株菌的5個生長時期對應的吸光度值為：SEA：a：遲緩期OD600=0.2；b：對數(shù)前期OD600=1.2；c：對數(shù)后期OD600=2.7；d：穩(wěn)定前期OD600=3.0；e：穩(wěn)定后期OD600=3.5；SEB：a：遲緩期OD600=0.016；b：對數(shù)前期OD600=0.025；c：對數(shù)后期OD600=2.28；d：穩(wěn)定前期OD600=2.33；e：穩(wěn)定后期OD600=2.35；SEE：a：遲緩期OD600=0.03；b：對數(shù)前期OD600=0.13；c：對數(shù)后期OD600=2.3；d：穩(wěn)定前期OD600=2.3；e：穩(wěn)定后期OD600=2.28。

由圖1可知，3株菌分別在經(jīng)過1 h、2 h、2 h的遲緩期后進入對數(shù)生長期，在5 h后逐漸達到穩(wěn)定前期；SEA和SEB一直處在穩(wěn)定前期和穩(wěn)定后期，沒有下降的趨勢，這可能與菌株有關(guān)系；SEE在14 h時逐漸呈下降趨勢，進入穩(wěn)定后期。

2.2 RT-qPCR試驗結(jié)果 在3株菌分別達到5個生長時期(遲緩期、對數(shù)前期、對數(shù)后期、穩(wěn)定前期、穩(wěn)定后期)對應吸光度值時，收集菌體并提取細菌總RNA，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，同時以16S rRNA作為內(nèi)標基因，分別以SEA、SEB、SEE、nuc四個基因進行RT-qPCR，繪制溶解曲線，如中插彩版圖2、3、4。由圖可知，所有溶解曲線均產(chǎn)生單一峰圖，不存在非特異性擴增，表明引物特異性良好，可進行后續(xù)表達規(guī)律研究。

圖1 金黃色葡萄球菌腸毒素基因A、B、E在液體培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.1 Growth curve of SEA、SEB、SEE in liquid medium

2.3SEA、SEB、SEE及nuc基因的表達規(guī)律 由圖5、6、7可知，4種基因均出現(xiàn)二次表達現(xiàn)象；SEA對應的nuc基因呈現(xiàn)基本一致的表達趨勢，SEA在穩(wěn)定前期表達量最高，nuc基因在對數(shù)后期表達量最高；nuc基因表現(xiàn)為二次升高；SEB在對數(shù)前期呈現(xiàn)升高，在對數(shù)后期卻又下降，在穩(wěn)定期高表達，表現(xiàn)為二次降低，與nuc基因的表達趨勢相反；SEE在穩(wěn)定后期達到峰值，表現(xiàn)為二次升高，也與nuc基因的表達一致；綜上，3種SE和nuc基因均出現(xiàn)二次升高或降低的現(xiàn)象，SEA與nuc基因的相對表達基本一致，SEB與nuc基因的相對表達相反，SEE與nuc基因的相對表達一致。

圖5 SEA及nuc基因在TSB培養(yǎng)基的表達規(guī)律Fig.5 Expression patterns of SEA and nuc gene in TSB注：結(jié)果以一株菌的目標基因在某時期的表達對于遲緩期的相對表達量為校準樣本；相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)；下圖同Note: According to the relative expression of the target gene of a strain in a certain period for its slow period was used as the calibration sample; same letter indicate insignificant (P>0.05); difference letters indicate significant (P<0.05). The same as following figures

圖6 SEB及nuc基因在TSB培養(yǎng)基的表達規(guī)律Fig.6 Expression patterns of SEB and nuc gene in TSB

圖7 SEE及nuc基因在TSB培養(yǎng)基的表達規(guī)律Fig.7 Expression patterns of SEE and nuc gene in TSB

3 討論

3.1 本試驗利用RT-qPCR對金黃色葡萄球菌SEA、SEB、SEE和nuc共4個毒力基因的表達模式進行了研究，結(jié)果表明不同腸毒素基因在某一時期的相對表達量差異較大，SEA和SEE的相對表達量要明顯低于SEB。Duquenne等[6]利用RT-qPCR研究奶酪中SEA和SED的表達情況，發(fā)現(xiàn)不同菌株在某一時期的表達量不同，細菌的濃度隨著SE基因的表達量而變化，導致其侵襲力也隨之升高或降低；SEA在穩(wěn)定前期達到高峰，在穩(wěn)定后期趨于平穩(wěn)；SEB在穩(wěn)定前期分泌量最大；SEE在對數(shù)后期高表達。Bergdoll等[7]也發(fā)現(xiàn)SEB的分泌量顯著高于其他SE，說明不同菌株的生長速度不同導致達到一定時期需要的時間不同，進而使每個基因在不同階段的表達有差異，這可能與金黃色葡萄球菌為了適應不斷變化的外界環(huán)境，其分泌的腸毒素及耐熱核酸酶的表達會隨著生長不同階段和環(huán)境因素的變化不斷調(diào)整所致[8]。

3.2 目前涉及SE及nuc表達規(guī)律相關(guān)性的研究鮮有報道。本試驗發(fā)現(xiàn)不同SE和nuc基因在某一時期的相對表達量差異較大，以SEB高表達，且與耐熱核酸酶基因的表達顯著相關(guān)；SEA在穩(wěn)定前期表達量最高，SEB在對數(shù)前期呈現(xiàn)升高，在對數(shù)后期卻又下降，在穩(wěn)定期高表達，表現(xiàn)為二次降低，SEE在穩(wěn)定后期達到高峰值，表現(xiàn)為二次升高，而與這3個基因相比，nuc基因在金葡菌生長的對數(shù)后期和穩(wěn)定期高表達，這與Smeltzer等[9]的研究結(jié)果一致，說明耐熱核酸酶能夠與腸毒素在基本相同的條件下合成，并且在食物儲存與加工的各種條件下都能保持和腸毒素相似的穩(wěn)定性，檢測食品中的耐熱核酸酶可以了解金黃色葡萄球菌腸毒素的污染情況，從而判定是否有引發(fā)食物中毒的可能性。同時本試驗結(jié)果還表明，4種基因均出現(xiàn)二次表達現(xiàn)象，推測可能與菌株中存在對其表達有激活或抑制作用因子相關(guān)。據(jù)報道SE和nuc基因在金黃色葡萄球菌中的表達由多個調(diào)控元件協(xié)調(diào)[10]，其中sae基因可以直接或者間接的上調(diào)耐熱核酸酶和SEB的表達，為下一步研究二者在金黃色葡萄球菌毒力調(diào)節(jié)，生理代謝及功能上的直接作用及調(diào)控機制提供了研究思路。