吳 楠 劉 侃 王曉梅

1.深圳市南山區(qū)疾病預(yù)防控制中心疾病預(yù)防科，廣東深圳 518054；2.深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部腫瘤研究所，廣東深圳 518000

肝癌是全球高發(fā)的腫瘤之一，惡性程度高，預(yù)后生存期短，致死率高[1]。抑癌基因失活是肝癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制中重要的遺傳學(xué)基礎(chǔ)[2]。2008年科學(xué)家應(yīng)用特異性高的RNAi 篩選方法[3]，得到了12個新的抑癌基因，XPO4 就是其中一種。XPO4是細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)因子家族成員，可調(diào)節(jié)Smad3[轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號傳導(dǎo)中的組分]和Eif5a（兩個密切相關(guān)的翻譯起始因子）[4-6]。XPO4 在細(xì)胞中的去除會引起細(xì)胞癌變的概率增加[7-8]。有研究表明，肝癌中XPO4 的表達(dá)降低與腫瘤大小及病理分級相關(guān)，XPO4 的缺失提示預(yù)后差，且可以作為一個獨(dú)立的危險因子[9-10]，目前利用XPO4基因開展腫瘤治療研究的報道較少。本研究構(gòu)建表達(dá)XPO4基因的載體，研究XPO4基因?qū)δ[瘤細(xì)胞的抑制作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1 購自Invitrogen公司；攜XPO4基因質(zhì)粒pCR4-TOPO-XPO4 購自Invitrogen公司；人肝癌細(xì)胞株SK-Hep1（XPO4基因完全缺失）由香港中文大學(xué)胡寶光博士惠贈；大腸埃希菌菌株DH5a 由深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部腫瘤研究所保存。

1.2 方法

1.2.1 pcDNA3.1-XPO4 載體的構(gòu)建 XPO4基因上游引物：5′-GGGGGTACCATGGTCAATAATGAACAA-3′；下游引物：5′-GGGGATATCTTATTTTACACAAAGGAG-3′。以pCR4-TOPO-XPO4 為模板，PCR 擴(kuò)增XPO4基因。酶切pcDNA3.1 質(zhì)粒和目的基因XPO4，16℃連接過夜（試劑盒購自Takara公司）。轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5a，無內(nèi)毒素質(zhì)粒提?。ㄔ噭┖匈徸設(shè)MEGA公司）。

1.2.2 細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染 將SK-Hep1 細(xì)胞接種至6 孔板，每孔2 mL，細(xì)胞密度為2×105個/mL，12 h后進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，pcDNA3.1-XPO4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SK-Hep1 細(xì)胞，按 照Lipofectamine3000 轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司）的說明書進(jìn)行。

1.2.3 蛋白表達(dá)檢測 按照Western Blot 實驗方法，主要試劑XPO4 一抗（Thermo公司）；β-actin 一抗（北京博奧森公司）；羊抗兔二抗（武漢博士德公司）。

1.2.4 XPO4基因體外抑瘤實驗 以SK-Hep1 細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，細(xì)胞密度為2×104個/mL。12 h后進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，采用CCK-8 檢測細(xì)胞存活率。將SK-Hep1 細(xì)胞接種至6 孔板，每孔2 mL，細(xì)胞密度為2×105個/mL，12 h后進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，采用Annexin V-FITC/PI 檢測細(xì)胞凋亡。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用T檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料用率表示，兩組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 XPO4基因PCR 產(chǎn)物鑒定

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測XPO4 的PCR 產(chǎn)物，在3000～4000 bp 有一條帶，大小與預(yù)期相符（圖1）。

2.2 重組載體的酶切鑒定

用KpnⅠ和EcorⅤ雙酶切pcDNA3.1-XPO4，對照質(zhì)粒為pcDNA3.1，XPO4基因正確插入pcDNA3.1載體中（圖2）。

2.3 pcDNA3.1-XPO4 轉(zhuǎn)染后XPO4 蛋白表達(dá)

圖1 XPO4 的PCR 擴(kuò)增圖

圖2 pcDNA3.1-XPO4 質(zhì)粒酶切圖

在重組質(zhì)粒pcDNA3.1-XPO4 轉(zhuǎn)染組中，有XPO4蛋白表達(dá)，在SK-Hep1 細(xì)胞對照組和pcDNA3.1 空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中，沒有XPO4 蛋白表達(dá)（圖3）。

圖3 Western BloT檢測XPO4 蛋白表達(dá)

2.4 pcDNA3.1-XPO4 體外對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

重組質(zhì)粒pcDNA3.1-XPO4 轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞存活率低于SK-Hep1 細(xì)胞對照組和pcDNA3.1 空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。SK-Hep1 細(xì)胞對照組的細(xì)胞存活率與pcDNA3.1 空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（圖4）。2.5 pcDNA3.1-XPO4 體外對腫瘤細(xì)胞凋亡的作用

圖4 CCK-8 檢測SK-Hep1 細(xì)胞增殖

重組質(zhì)粒pcDNA3.1-XPO4 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的早期凋亡率[（13.89±1.62）%]高于SK-Hep1 細(xì)胞對照組[（5.14±1.13）%]和pcDNA3.1 空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組[（5.79±2.11）%]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。SK-Hep1 細(xì)胞對照組細(xì)胞的早期凋亡率與pcDNA3.1 空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（圖5）。

3 討論

圖5 Annexin V-FITC/PI 檢測XPO4 表達(dá)對SK-Hep1 細(xì)胞凋亡的影響

肝癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，常與相關(guān)基因的突變或積累有關(guān)?；蛑委熞殉蔀榘┌Y治療的重要研究領(lǐng)域，因此，尋找高效的抑癌基因是腫瘤治療進(jìn)一步發(fā)展的重要方向。近年來研究發(fā)現(xiàn)，真核細(xì)胞的細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間存在物質(zhì)交換，細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)輸出許多種類的大分子。出核轉(zhuǎn)運(yùn)通過核孔復(fù)合物（NPC）通道和選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，同時也依賴核輸出信號結(jié)合受體，如XPO4[4]。XPO4 也稱為Exportin 4，可能是一種重要的抑癌基因。本研究探討XPO4 在人肝癌細(xì)胞株SKHep1 中的表達(dá)對該腫瘤細(xì)胞生長增值的影響，結(jié)果顯示，pcDNA3.1-XPO4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SK-Hep1 肝癌細(xì)胞中，XPO4 在SK-Hep1 中表達(dá)。表達(dá)的XPO4可以抑制SK-Hep1 細(xì)胞的生長增殖和誘導(dǎo)凋亡。XPO4 抑制腫瘤的機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)Eif5a 和Smad3 蛋白水平來進(jìn)行[11]。細(xì)胞中XPO4 缺失，影響Smad3 出核，而Smad3 蛋白是TGF-β 的配體，細(xì)胞核Smad3 的增加，伴隨TGF-β基因上調(diào)，這種影響很好地解釋了當(dāng)XPO4基因缺失導(dǎo)致TGF-β信號通路的紊亂，使細(xì)胞逃逸TGF-β 介導(dǎo)的生長抑制效應(yīng)，導(dǎo)致多種腫瘤發(fā)生[5，12-13]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Eif5a 在人癌細(xì)胞中總體上來說是過度表達(dá)的，腫瘤的惡性程度尤其是腫瘤的惡性增值能力、轉(zhuǎn)移能力與腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的Eif5a密切相關(guān)，如果細(xì)胞內(nèi)缺乏XPO4 則有助于Eif5a 的出核，通過XPO4-Eif5a 這一信號通路刺激腫瘤細(xì)胞增殖[14-16]。

為了揭示XPO4 對腫瘤細(xì)胞的影響，本研究制備了攜帶表達(dá)XPO4基因的pcDNA3.1-XPO4 質(zhì)粒載體，選擇肝癌細(xì)胞SK-Hep1 進(jìn)行實驗。SK-Hep1 細(xì)胞系中缺失XPO4基因，通過轉(zhuǎn)染SK-Hep1，引起XPO4在細(xì)胞中表達(dá)。CCK-8 檢測細(xì)胞增殖顯示，重組質(zhì)粒pcDNA3.1-XPO4 轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞存活率低于SK-Hep1細(xì)胞對照組和pcDNA3.1 空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），提示XPO4基因表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞生長。重組質(zhì)粒pcDNA3.1-XPO4 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的早期凋亡率高于SK-Hep1 細(xì)胞對照組和pcDNA3.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），提示XPO4基因表達(dá)對腫瘤細(xì)胞有殺傷作用。SK-Hep1 細(xì)胞對照組的細(xì)胞存活率和早期凋亡率和pcDNA3.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），提示XPO4基因可能參與并發(fā)揮重要的抑制腫瘤進(jìn)程的作用。

Liang 等[10]通過對臨床肝癌手術(shù)患者的病理檢測，發(fā)現(xiàn)XPO4 在癌旁組織中的表達(dá)，高于腫瘤組織，且腫瘤越大表達(dá)量越低，提示XPO4可能參與腫瘤進(jìn)程。Zender 等[11]將肝癌易感小鼠模型和RNAi 技術(shù)結(jié)合，在小鼠模型中將XPO4 沉默后可引起腫瘤，因此也進(jìn)一步獲得XPO4 作為抑癌基因的證據(jù)。

綜上所述，肝癌細(xì)胞系SK-Hep1 模型不表達(dá)XPO4，而通過構(gòu)建的重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染，可以在肝癌細(xì)胞成功表達(dá)XPO4基因，有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)凋亡。因此XPO4基因作為抑癌基因?qū)δ[瘤治療具有極大的潛力，增強(qiáng)XPO4基因的表達(dá)可以為臨床治療肝癌提供參考依據(jù)。同時仍需深入研究肝癌的發(fā)生機(jī)制[17-18]，更好地了解XPO4基因抑癌的原因，為疾病的診斷與治療提供新的方向。