班智慧， 于孟嬌， 付文波

(中央司法警官學(xué)院偵查學(xué)教研室， 河北 保定 071000)

毒物是指在一定條件下以較小劑量進(jìn)入生物體后，發(fā)生生物化學(xué)作用，使生物體器官組織功能或形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生損害甚至造成生物機體死亡的外源性化學(xué)物質(zhì)[1]。毒物與藥物之間沒有截然的界限，盲目濫用可造成中毒甚至死亡。在我國，動物常被作為藥用或食用，如蟾蜍、毒蛇經(jīng)常被用于泡酒，過量食用可引發(fā)機體中毒。然而有毒動物毒素成分復(fù)雜，許多動物譜系獨立地進(jìn)化了毒液系統(tǒng)，且毒素屬于天然有機成分，毒素結(jié)構(gòu)不易檢索；機體中毒后，體內(nèi)毒素含量甚少，不易富集、提??；并且毒素進(jìn)入體內(nèi)，經(jīng)消化液分解、與體內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合等有機過程，毒素成分發(fā)生變化，毒性強度各不相同等這些因素都使得動物毒素的定性、定量檢驗困難重重。本文從常見動物毒素出發(fā)，對其各自的理化特性以及檢驗方法進(jìn)行闡述，總結(jié)歸納當(dāng)下常見動物毒素的檢測方法，旨在為刑事科學(xué)技術(shù)工作人員提供檢驗參考。

1 常見動物毒素概述

1.1 蛇毒素

1.1.1 蛇毒素的理化特性 毒蛇的頭部毒腺能夠分泌毒液,大部分屬于酶類，含有10多種酶類,如精氨酸酯酶、膠原蛋白酶等[2]。蛇毒素外觀呈蛋清樣黏稠液體，新鮮蛇毒呈微酸性、透明微黃色、有特殊腥味，含水量為65%～80%，具有廣泛的生物學(xué)活性,含多種蛋白質(zhì)、多肽、酶類和其他小分子物質(zhì)，經(jīng)真空冰凍干燥處理后成為松脆易碎的半透明固體，干燥蛇毒可保存多年[3]。

1.1.2 蛇毒素的毒理作用 蛇毒中毒最常見的原因是被毒蛇意外咬傷引起，也有少數(shù)中毒是將蛇毒提純后將純品毒液通過肌內(nèi)注射方式進(jìn)行自殺或他殺引起的。各種蛇毒所含成分不同，其作用于機體出現(xiàn)的中毒癥狀也不同。蛇咬傷中毒主要以腦、心、肺、肝、腎、淋巴結(jié)等組織器官損害較重[4]，血液和循環(huán)系統(tǒng)的損害表現(xiàn)癥狀如心力衰竭、心律失常、出血性休克等；神經(jīng)系統(tǒng)的損害癥狀表現(xiàn)為骨骼肌運動麻痹乃至外周呼吸麻痹；實驗室檢查可表現(xiàn)出肝腎功能、心肌酶譜、電解質(zhì)和凝血結(jié)果異常[5]。

1.2 河豚(河鲀)毒素

1.2.1 河豚毒素的理化特性 河豚毒素是一種氨基全氫喹唑啉型化合物，240 ℃開始碳化，但300 ℃以上也不分解。微溶于水，易溶于稀乙醇，微溶于水和乙醇，不溶于油脂和脂溶性有機溶劑，粗制品為棕黃色粉末，精制品為白色無定形粉末。河豚毒素是一種天然劇毒毒素，是一種非蛋白的強神經(jīng)毒，對生物堿類試劑不發(fā)生任何沉淀與顏色反應(yīng)。河豚毒素分子式為C11H17N3O8，其分子結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 河豚毒素分子結(jié)構(gòu)

1.2.2 河豚毒素的毒理作用 河豚中毒多因誤食引起，食用者或者不了解河豚含有劇毒，誤食內(nèi)臟或不新鮮的魚肉，或者食用處理、烹飪方法不得當(dāng)而引起中毒。河豚毒素主要通過麻痹神經(jīng)中樞和神經(jīng)末梢，血液中膽堿酯酶被抑制，神經(jīng)肌肉系統(tǒng)被嚴(yán)重麻痹，阻止神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)，進(jìn)而引起中樞神經(jīng)失調(diào)。中毒者首先發(fā)生胃部不適，隨后逐漸出現(xiàn)全身不適，最后因呼吸中樞麻痹或房室傳導(dǎo)阻滯而死亡。

1.3 斑蝥素

1.3.1 斑蝥素的理化特性 斑蝥素，亦稱為斑蝥酸酐，為節(jié)肢動物斑蝥體內(nèi)的主要毒性物質(zhì)。斑蝥素?zé)o色、有光澤、斜方形小片結(jié)晶，微溶于乙醇、熱水，能溶于丙酮及油脂，但不溶于冷水。斑蝥素遇稀堿生成鹽，其溶液再調(diào)成酸性，則又析出斑蝥素[6]。斑蝥素的分子式為C10H12O4，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖2。

圖2 斑蝥素的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.3.2 斑蝥素的毒理作用 出現(xiàn)斑蝥中毒或因為錯誤用于墮胎、治療月經(jīng)不調(diào)引起，或誤作偏方治療肺膿腫引起消化道出血引起。斑蝥素中毒會引發(fā)口腔及咽喉有燒灼感、疼痛，口腔黏膜出現(xiàn)水泡或潰瘍等消化道癥狀；或者會發(fā)生尿頻、尿道燒灼感、血尿等生殖器官炎癥。嚴(yán)重者可出現(xiàn)頭暈、頭痛、腹痛、心跳加快、肢端發(fā)紺、口唇青紫等神經(jīng)系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)癥狀，最終昏迷而死。中毒到死亡時間較快，快則30 min，慢則1～3 h死亡。

2 常見動物毒素檢驗方法

在刑事技術(shù)鑒定中，毒物物證多為生物檢材，如血液、肝、腎、尿、胃內(nèi)容物等。這就要求在進(jìn)行相關(guān)檢測時，首先要將毒素或其代謝物從血液、肝臟、尿液等檢材中提取出來，并進(jìn)行凈化，才能進(jìn)行檢測。檢材的提取通常采用溶劑溶解法、液-液萃取法或者固相微萃取法進(jìn)行提取。本部分闡述的檢測方法是通過文獻(xiàn)檢索方式，搜集的動物體內(nèi)毒素檢測的方法，對于人體中或者尸體中檢材含量的定性定量分析，參照此方法進(jìn)行。

2.1 蛇毒素的檢驗方法

2.1.1 法醫(yī)毒理學(xué)檢驗 根據(jù)蛇咬傷的癥狀進(jìn)行初步檢驗，一般都會在身體暴露部位出現(xiàn)毒蛇牙痕，并且被咬傷口周圍組織高度腫脹、麻木壞死，并迅速擴展到周圍組織。中毒死亡者可根據(jù)尸檢結(jié)果判斷，若出現(xiàn)腫脹組織下有淡紅色水腫液滲出，皮下出血明顯，并且局部淋巴結(jié)腫大等癥狀則可能是毒蛇咬傷中毒致死。

2.1.2 生物學(xué)檢驗方法 雙向免疫擴散法：用pH值為8.6的巴比妥鈉緩沖液配制質(zhì)量濃度1%的瓊脂糖凝膠，厚度2～3 mm，自然冷卻后打孔，孔距10 mm，在火焰上緩緩加熱以封底，中心孔加抗銀環(huán)蛇血清，周圍加蛇毒及檢材抗原，每孔均加液量15 mL，置于37 ℃水浴箱24～48 h，觀察結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和檢材抗原之間出現(xiàn)白色沉淀線者為陽性，不出現(xiàn)沉淀線者為陰性。本方法適用于毒素含量較高的檢材初檢，如傷口附近提取的血液檢材。

2.2 河豚毒素的檢驗方法 河豚毒素的提取方法主要包括乙酸提取法、改良乙酸提取法、樹脂提取法、甲醇提取法等。檢測方法主要有小鼠生物法、膠體金免疫層析法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等。

2.2.1 小鼠生物法 小鼠生物法(以30 min內(nèi)將一體質(zhì)量20 g小鼠致死所用河豚毒素的量為一鼠單位)是最常用、最直觀的檢測方法，通過小鼠死亡前所呈現(xiàn)出的典型的河豚毒素中毒癥狀，將河豚毒素與其他致死性物質(zhì)區(qū)分開。其原理是，一定體質(zhì)量的小鼠經(jīng)腹腔注射河豚毒素后，其死亡時間的倒數(shù)與注射河豚毒素劑量之間存在著線性關(guān)系，由此可根據(jù)小鼠死亡時間推斷河豚毒素的含量。但實際使用時因個體差異大、重現(xiàn)性較差，對于精確定量具有很大的局限性。

2.2.2 膠體金免疫層析法 深圳市計量質(zhì)量檢測研究院張世偉等[7]建立了河豚毒素的膠體金免疫層析檢測方法，主要用于河豚毒素快速定性檢測，其所建立的河豚毒素檢測方法IC50為48 ng·mL-1,線性范圍為(10～160) μg·L-1(y=-0.20lnx+1.23,R2=0.98)[7]。另有林壯森等[8]應(yīng)用小鼠生物實驗和間接競爭抑制酶聯(lián)免疫吸附實驗的方法同步測量河豚毒素含量。

2.2.3 高效液相色譜—質(zhì)譜法 駱和東等[9]建立了液相色譜-質(zhì)譜法測定織紋螺中河豚毒素的分析方法。其將螺肉中可食用部分進(jìn)行勻質(zhì)，用0.03 mmol·L-1乙酸溶液提取,水浴加熱10 min,用Sep-Pak C18固相萃取柱凈化,再用截留相對分子質(zhì)量為3 000的超濾管過濾。采用Insertsil ODS-3色譜柱分離,以含有30 mmol·L-1七氟丁酸的甲酸銨溶液 (1 mmol·L-1) -甲醇 (體積比為99∶1) 為流動相,采用電噴霧離子源,選擇離子監(jiān)測模式檢測。以保留時間和河豚毒素的二級質(zhì)譜特征碎片離子予以定性確證。結(jié)果表明,在此分析條件下,可將河豚毒素及其衍生物分離,在0.01～10.00 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好 (r2>0.995),檢出限 (以3倍信噪比為計) 為2 μg·L-1。

2.3 斑蝥素檢驗方法 斑蝥藥材中斑蝥素的提取工藝主要包括有堿水法、酸水解法、超聲波提取法和熱回流法。斑蝥素中毒樣品處理時，參考斑蝥藥材提取工藝，采用低濃度氫氧化鈉溶液煎煮處理或超聲波提取方法。酸水解法提取樣品中的斑蝥素時，加入適量丙酮、三氯甲烷及數(shù)滴濃鹽酸，沸騰回流后，將提取液濃縮。斑蝥素及其衍生物的分析方法主要包括法醫(yī)毒理學(xué)方法、薄層色譜法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜法等。

2.3.1 法醫(yī)毒理學(xué)方法 斑蝥素中毒可以引發(fā)強烈的消化道癥狀、泌尿系統(tǒng)癥狀。根據(jù)中毒者所出現(xiàn)的中毒癥狀是否符合斑蝥素中毒癥狀進(jìn)行初步判斷，若是中毒死亡者則可以根據(jù)尸體檢查情況進(jìn)行判斷。

2.3.2 化學(xué)檢驗法 本方法主要為微量升華結(jié)晶和斑蝥酸鋇結(jié)晶試驗，適用于斑蝥蟲樣本中斑蝥素含量的測定。用吸管吸取1 mg·mL-1斑蝥素乙酸乙酯液，滴1滴在凹穴載玻片的凹穴中，揮干溶劑后，用一潔凈的平面載玻片蓋上，頂部覆蓋一片濕潤的濾紙，用試管夾夾住兩片載玻片，底部用小火加熱片刻，冷卻后，將上面的載玻片翻轉(zhuǎn)后置顯微鏡下，觀察斑蝥素升華物的透明棒狀或棱柱狀結(jié)晶形態(tài)，然后在升華物上加1 mol·L-1Ba(OH)2溶液一滴，用蓋玻片覆蓋液體，再置顯微鏡下觀察生成的斑蝥酸鋇束狀針晶簇，另吸取斑蝥蟲樣本液，重復(fù)上述操作，觀察升華物和Ba(OH)2反應(yīng)物的形態(tài)，并與已知斑蝥素的形態(tài)進(jìn)行對比[10]。

2.3.3 氣相色譜法 斑蝥素為內(nèi)酸酐化合物，遇堿可開環(huán)成鹽而溶于水，酸化后又可閉環(huán)重新轉(zhuǎn)變成斑蝥素，利用此性質(zhì)可對樣品進(jìn)行凈化處理；斑蝥素分子較小，易氣化，適合用氣象色譜法和氣質(zhì)聯(lián)用法進(jìn)行鑒定。適用于生物檢材，如胃內(nèi)容物、血液中的斑蝥素成分的分析。

在確定的色譜條件下，分別吸取斑蝥蟲提取樣液和生物檢材提取樣液進(jìn)行進(jìn)樣測定，記錄色譜圖并與已知斑蝥素樣本進(jìn)行對比，如果檢材色譜圖中出現(xiàn)與已知斑蝥素樣本保留時間相同或相近的色譜峰，調(diào)整色譜條件，使斑蝥素的保留時間適當(dāng)延長，再次進(jìn)樣對比，根據(jù)保留時間對比結(jié)果判斷檢材中是否含有斑蝥素。有些生物毒素的制備方法除了從來源物中提取之外，還可以進(jìn)行人工合成[11]。

3 討論

有毒動物利用多肽毒素進(jìn)行捕食和防御，表現(xiàn)出驚人的分子多樣性，其分子多樣性至今仍然是各國學(xué)者正在深入探究的熱門科學(xué)問題[12]。本文通過對常見動物毒素，蛇毒素、河豚毒素、斑蝥素的理化特性和毒理作用分析，采用文獻(xiàn)檢索的方法，對目前相關(guān)毒素的實驗室檢測方法進(jìn)行總結(jié)歸納，希望可以為刑事科學(xué)技術(shù)人員解決毒素檢驗效率低和準(zhǔn)確率的問題提供幫助。但是在實驗室的實驗樣本中，樣本毒素含量較高，且毒素提取時間及時，測定結(jié)果相對較好，然而，在實際案件中，毒物檢材多為血液、肝、腎、尿、胃內(nèi)容物等，毒素含量較低，再加上提取不及時、消化液的分解、毒素與體內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)合等因素的影響，毒素成分會發(fā)生相應(yīng)的變化，以上方法可以作為參考，在實際案件處理中需要更加精確的分析儀器，更先進(jìn)的檢材提取方法。