劉金蓮 張建軍 劉曦 張睿 樂娜 張爍 王林元 王淳

輔助降血脂是目前中國保健食品的27個保健功能之一，根據(jù)藥智網(wǎng)最新數(shù)據(jù)顯示，具有輔助降血脂功能的保健食品共1717種，占所有保健產(chǎn)品的9.8%，經(jīng)初步統(tǒng)計，其中有近一半以上以中藥為原料的產(chǎn)品，這類保健食品安全性比藥品高、生物活性比普通食品強，契合了大健康和治未病的發(fā)展要求，在養(yǎng)生保健、提高抵抗疾病能力方面發(fā)揮著重要的作用，在市場中起主導(dǎo)地位[1]。但是，目前中藥類保健食品的應(yīng)用缺乏中醫(yī)理論的指導(dǎo)，缺少規(guī)范的中醫(yī)功效評價標準，其適宜人群也沒有根據(jù)中醫(yī)證型分類，導(dǎo)致其應(yīng)用針對性不強，保健作用不能很好的發(fā)揮。因此，本實驗通過建立脾虛濕盛型高脂血癥動物模型，研究紅曲茯苓片的健脾祛濕降血脂作用，將中醫(yī)藥辨證理論與輔助降血脂功能相結(jié)合，對研發(fā)更加安全、有效、精準的中藥復(fù)方輔助降血脂保健產(chǎn)品具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品

紅曲茯苓片由山楂5 g(批號：19032223)、葛根5 g(批號：19022113)、白術(shù)3 g(批號：19021523)、茯苓5 g(批號：18121516)、紅曲1 g(批號：19012151)組成，其中山楂、葛根、白術(shù)、茯苓購于北京同仁堂藥店；紅曲(洛伐他丁0.8%含量)由武漢佳成生物制品有限公司提供，符合GB4926-2008《食品添加劑紅曲米(粉)》要求，以上中藥經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院科研實驗中心李偉副主任藥師鑒定。

血脂康(北京北大維信生物科技有限公司，批號： Z10950029)

1.2 實驗動物

SPF級雄性健康SD大鼠，體重(180±20) g，購自斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司[許可證號：SCXK(京)2019-0010]。整個實驗過程中大鼠自由飲水，室溫20～22℃，相對濕度為60%～70%，燈照周期為12小時，7:00～19:00燈照，19：00～7：00黑暗。

1.3 主要試劑盒

甘油三酯(triglycerides，TG)試劑盒(優(yōu)爾生生物科技有限公司，批號：C0612019006)；總膽固醇(total cholesterol，TC)試劑盒(優(yōu)爾生生物科技有限公司，批號：C0632019004)；高密度脂蛋白(high density lipoprotein cholesterol，HDL)試劑盒(優(yōu)爾生生物科技有限公司，批號：2019003)；低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)試劑盒(優(yōu)爾生生物科技有限公司，批號：2019004)；胃動素(motilin，MTL)試劑盒(優(yōu)爾生生物科技有限公司，批號：L191007431)；胃泌素(gastrin，GAS)試劑盒(優(yōu)爾生生物科技有限公司，批號：L191007442)；白蛋白(albumin,ALB)試劑盒(優(yōu)爾生生物科技有限公司，批號：L191005419 )；醛固酮(aldosterone，ALD)試劑盒(優(yōu)爾生生物科技有限公司，批號：L190902584)； 胰蛋白酶(trypsin，TPS)試劑盒(優(yōu)爾生生物科技有限公司，批號：L190807291)；血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)試劑盒(優(yōu)爾生生物科技有限公司，批號：L190828363)；膽堿酯酶(cholinesterase，CHE)試劑盒(南京建成生物科技有限公司,批號：20191028)。

1.4 分組和給藥

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機分為空白組、脾虛濕盛型高脂血癥模型組、血脂康組(0.2 g/kg)、紅曲茯苓片低劑量組(0.79 g/kg，相當于人9.5 g/天)、紅曲茯苓片中劑量組(1.58 g/kg，相當于人19 g/天)、紅曲茯苓片高劑量組(4.75 g/kg，相當于人57 g/天)，每組10只。除空白組、模型組外，其余各組大鼠每天上午給予相應(yīng)藥物，灌胃劑量為1 mL/100 g體重，根據(jù)體重變化調(diào)整灌胃量，空白組、模型組給予相應(yīng)體積的生理鹽水，連續(xù)4周。

1.5 造模方法

建立由高脂飼料喂養(yǎng)、飲食不節(jié)和游泳勞倦損傷脾氣復(fù)合因素造脾虛濕盛高脂血癥模型。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后開始造模，造模時間28天：給予高脂飼料(高脂飼料：在維持飼料中添加 20.0%蔗糖、15%豬油、1.2%膽固醇、0.2%膽酸鈉，適量的酪蛋白、磷酸氫鈣、石粉等)并采用每日力竭游泳復(fù)合飲食不節(jié)(飽食1天，禁食1天，自由飲水)造模，根據(jù)《脾虛證動物模型的客觀評估》對大鼠脾虛證進行評估，當大鼠出現(xiàn)游泳耐力下降、體重減輕、食量減少、活動減少、安靜倦怠、毛色枯槁無光澤等表現(xiàn)時，證明脾虛模型造模成功[2]。

1.6 檢測指標與方法

1.6.1 一般狀況 每日觀察記錄各組大鼠的精神狀態(tài)、毛發(fā)光澤度、二便以及進食量和體重等。

1.6.2 血脂指標 腹主動脈采血，靜置2小時后，3000 r/分鐘離心15分鐘，分離出血清，采用ELISA試劑盒方法測定血清 TC、TG、LDL、HDL 血脂四項水平。

1.6.3 脾虛相關(guān)指標 按ELISA試劑盒說明書檢測GAS、MTL、TPS、CHE含量。

1.6.4 濕濁相關(guān)指標 按ELISA試劑盒說明書檢測ALB、ALD、VIP含量。采用免疫組化法測定胃組織AQP3、AQP4，腸組織AQP3、AQP4 蛋白含量。以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，經(jīng)脫蠟、水化，抗原修復(fù)，SABC法染色，脫水、透明、封片、鏡檢，觀察蛋白表達。并用Image-proplus 6.0圖像處理在同等條件下檢測每張組織切片中表達的平均積分光密度(A)值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般狀況觀察

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)期間，各組大鼠毛色、飲食、二便、精神狀態(tài)等均正常，沒有明顯差異。造模開始后，模型組大鼠漸漸出現(xiàn)毛色干枯發(fā)黃，沒有光澤，大便稀溏，精神狀態(tài)差等情況。給藥組大鼠毛發(fā)整齊，進食量增加，精神狀態(tài)良好。

2.2 紅曲茯苓片對脾虛濕盛型高脂血癥復(fù)合模型大鼠進食量、體重的影響

與空白組相比，復(fù)合模型組進食量減少(P<0.01)，與模型組相比，各給藥組大鼠進食量顯著增加，并逐漸趨于正常(P<0.01)，與血脂康組相比，紅曲茯苓片高劑量組進食量增加(P<0.01)。結(jié)果見表1。

表1 紅曲茯苓片對脾虛濕盛型高脂血癥復(fù)合模型大鼠進食量的影響

實驗開始第 1 天各組大鼠之間體質(zhì)量無顯著性差異(P>0.05)。實驗第14、28天，復(fù)合模型組大鼠體質(zhì)量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。造模結(jié)束后，各給藥組大鼠體質(zhì)量均有增加，以血脂康組、紅曲茯苓片高劑量組體質(zhì)量增加顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，結(jié)果見表2。

表2 紅曲茯苓片對脾虛濕盛型高脂血癥復(fù)合模型大鼠體重的影響

2.3 紅曲茯苓片對脾虛濕盛型高脂血癥復(fù)合模型大鼠血脂的影響

與空白組相比，模型組大鼠TG、TC、LDL-C含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，HDL-C水平變化不顯著(P>0.05)。

與模型組相比，各給藥組大鼠TG含量均有一定程度的降低，血脂康組、紅曲茯苓片低、中、高劑量組差異顯著(P<0.01、P<0.05、P<0.01、P<0.01)。各給藥組大鼠TC含量均有一定程度的變化，血脂康組、紅曲茯苓片高劑量組顯著降低(P<0.05)。各給藥組大鼠LDL含量均有一定程度的降低，血脂康組、紅曲茯苓片高劑量組顯著降低(P<0.05、P<0.01)。各給藥組大鼠HDL含量均顯著升高(P<0.05)。

與血脂康組相比，紅曲茯苓片低、中劑量組TC含量增加(P<0.01、P<0.05)，紅曲茯苓片高劑量組LDL含量降低(P<0.05)。結(jié)果見表3。

表3 紅曲茯苓片對脾虛濕盛型高脂血癥復(fù)合模型大鼠血脂的影響

2.4 紅曲茯苓片對脾虛濕盛型高脂血癥復(fù)合模型大鼠血清中脾虛相關(guān)指標的影響

與空白組相比，復(fù)合模型組大鼠GAS、MTL、TPS含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，CHE升高(P<0.05)。

與模型組相比，各給藥組大鼠GAS水平均增加(P<0.01)。各給藥組除紅曲茯苓片低劑量組差異不顯著外，其余組MTL水平均升高，即血脂康組、紅曲茯苓片中、高劑量組(P<0.01)，各給藥組大鼠TPS水平均有一定程度的升高(P<0.01)。各給藥組大鼠CHE水平均降低(P<0.05,P<0.01)。但其中血脂康組、紅曲茯苓片低劑量組結(jié)果接近(P<0.05)，紅曲茯苓片中、高劑量組差異更為顯著(P<0.01)。

與血脂康組相比，紅曲茯苓片中、高劑量組GAS含量增加(P<0.01)，高劑量組MTL含量增加(P<0.01)，低劑量組TPS含量減少(P<0.05)。結(jié)果見表4。

表4 紅曲茯苓片對脾虛濕盛型高脂血癥復(fù)合模型大鼠GAS、MTL、TPS、CHE的影響

2.5 紅曲茯苓片對脾虛濕盛型高脂血癥復(fù)合模型大鼠血清中濕濁相關(guān)指標的影響

與空白組相比，模型組大鼠ALB水平降低(P<0.01)，ALD水平升高(P<0.05)，VIP水平升高(P<0.05)。

與模型組比，各給藥組大鼠ALB水平均有升高趨勢，其中紅曲茯苓片中、高劑量組明顯增加(P<0.05)，各給藥組大鼠ALD水平均有相應(yīng)的變化，差異不顯著，紅曲茯苓片高劑量組ALD水平顯著降低(P<0.05)，各給藥組大鼠VIP水平均降低，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表5。

表5 紅曲茯苓片對脾虛濕盛型高脂血癥復(fù)合模型大鼠ALB、ALD、VIP的影響

與空白組相比，復(fù)合模型組大鼠胃、腸組織中AQP3 水平均顯著性降低(P<0.01)，AQP4 水平均顯著性升高(P<0.01)。

與模型組相比，各給藥組大鼠胃組織AQP3 水平均有一定程度的增加(P<0.01、P<0.05、P<0.01、P<0.01)，腸組織AQP3 水平也有不同程度的提高(P<0.01)。各給藥組大鼠胃組織AQP4水平均有一定程度的降低，其中血脂康組和紅曲茯苓片高劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。各給藥組大鼠腸組織AQP4水平也有不同程度的下降，血脂康組、紅曲茯苓片中、高劑量組差異顯著(P<0.01)。

與血脂康相比，紅曲茯苓片低、中、高劑量組能增加腸AQP3含量(P<0.01)，增加AQP4含量(P<0.01)，結(jié)果見表6、圖1～4。

表6 紅曲茯苓片對脾虛濕盛型高脂血癥復(fù)合模型大鼠胃、腸組織AQP3、AQP4 的影響

注： A:空白組；B:復(fù)合模型組；C:血脂康組；D：紅曲茯苓片低劑量組；E：紅曲茯苓片中劑量組；F：紅曲茯苓片高劑量組。

注： A:空白組；B:復(fù)合模型組；C:血脂康組；D：紅曲茯苓片低劑量組；E：紅曲茯苓片中劑量組；F：紅曲茯苓片高劑量組。

注： A:空白組；B:復(fù)合模型組；C:血脂康組；D：紅曲茯苓片低劑量組；E：紅曲茯苓片中劑量組；F：紅曲茯苓片高劑量組。

3 討論

高脂血癥在中國的發(fā)病率已經(jīng)達到20%，成年人中血脂異常的患者接近1.6億[3]。血脂異常發(fā)生的過程較緩慢、隱匿性強，發(fā)展初期大多數(shù)人并無明顯癥狀和體征，不易被察覺，且長時間的血脂異常波動是誘發(fā)心腦血管等疾病的重要危險因素，嚴重威脅著人類的健康。中醫(yī)將高脂血癥歸為“脂”“膏”“濁”等范疇，“膏”“濁”也是濕邪的一種，濕為濁之漸，高脂血癥也屬濕濁性質(zhì)。濕困脾胃，脾虛精微不化，痰濕內(nèi)生。脾虛與濕濁相互影響，惡性循環(huán)，瘀阻于血脈，血液運行不暢，清濁不分而發(fā)為血脂異常。有學(xué)者通過對 351 例血脂異常患者的中醫(yī)臨床證候類型研究發(fā)現(xiàn)，脾虛痰濕證所占比例最大[4]。因此本實驗研究的是最為常見的脾虛濕盛型高脂血癥。

紅曲茯苓片是以中醫(yī)基礎(chǔ)理論為指導(dǎo)，根據(jù)臨床治療的經(jīng)驗經(jīng)中醫(yī)藥專家科學(xué)論證，結(jié)合近年來的研究進展，針對血脂異常屬于中醫(yī)脾虛濕盛證型的人群以健脾祛濕、化濁降脂為保健法則總結(jié)創(chuàng)制而成的治療脾虛濕盛型血脂異常的全新復(fù)方，主要由紅曲、白術(shù)、茯苓、山楂、葛根 5 味藥物組成。紅曲具有健脾消食、活血化瘀、化濁降脂之功，可用于脾虛失運、痰濁阻滯、血瘀阻絡(luò)的血脂異常。白術(shù)健脾益氣，燥濕利水，用于脾虛食少，消化不良，二者配伍，健運脾胃，燥化濕濁，標本兼治，用為君藥。茯苓有滲濕、健脾之功。山楂消食健胃，行氣散瘀，對高脂血癥有很好的治療作用，二者同用，能增強君藥的健脾燥濕，消食化積、化濁降脂之功。葛根與白術(shù)、茯苓同用，增強健脾助運、升發(fā)清陽之功，全方合理配伍，健脾祛濕化濁以治病求本，降低血脂；并能活血散瘀以防患未然，通利血脈。以健脾祛濕，化濁降脂立法，切中病機，標本兼治。其中茯苓、山楂、葛根既是食品又是藥品，紅曲、白術(shù)可用于保健食品的真菌及中藥，符合中國現(xiàn)行法規(guī)對保健食品原料的要求[5]。根據(jù)紅曲茯苓片組成藥物的藥性藥效及其主要的功能主治，基于“方證相應(yīng)”的理論可知紅曲茯苓片可應(yīng)用于脾虛濕盛證，因此在保健食品功能評價所用脂代謝紊亂模型[6]基礎(chǔ)上建立脾虛濕盛證動物模型，通過飽食一天、禁食一天模擬人體飲食不節(jié)，結(jié)合力竭游泳導(dǎo)致勞倦過度，飲食不節(jié)、勞倦過度則導(dǎo)致脾氣虛弱，脾失健運，水谷精微不歸正化，則津液代謝異常、濁脂內(nèi)生，以此建立脾虛濕盛證候。本實驗選取的陽性對照藥為血脂康膠囊，是中藥紅曲的提取物，同樣具有化濁降脂、活血化瘀、健脾消食的中醫(yī)功效，因其療效確切，不良反應(yīng)少，被廣泛用于高脂血癥。因此，以血脂康對比研究中藥復(fù)方健脾祛濕降脂作用。

GAS、MTL、TPS、CHE是評價脾胃功能的客觀指標[7-13]。陳貴堂[14]研究發(fā)現(xiàn)黃連溫膽湯能提高患者MTL、GAS水平改善脾胃濕熱型胃痞病患者納呆、腹部不適、噯氣等胃腸道癥狀。TPS為肽鏈內(nèi)切酶，有學(xué)者認為脾虛與該酶活性關(guān)系密切[12]。當機體處于脾虛狀態(tài)時，GAS、MTL、TPS水平降低。結(jié)果表明紅曲茯苓片中、高劑量組對于GAS改善優(yōu)于血脂康組，且高劑量組對于MTL的改善優(yōu)于血脂康組。CHE是臨床研究中的重要指標，該酶有調(diào)節(jié)胃腸消化蠕動的能力，部分臨床醫(yī)生在進行血清生化指標檢查中發(fā)現(xiàn)當患者TC、TG等水平升高時，CHE活性也有明顯增加，將其作為臨床檢測脂肪肝的重要指標[15]，CHE水平可以同時反映血脂和脾虛的變化。實驗結(jié)果表明，紅曲茯苓片低、中、高劑量組都能降低CHE水平。這說明紅曲茯苓片和血脂康都能發(fā)揮健脾功效，但紅曲茯苓片中、高劑量組健脾作用更強。復(fù)方中紅曲健脾消食，白術(shù)健脾益氣，茯苓亦能健脾，三者配伍，共同發(fā)揮健運脾胃的功效。

ALB是血漿中含量最多的蛋白質(zhì)，可維持血液膠體滲透壓。臨床研究中常將ALB作為判定水液代謝(水腫)發(fā)生的一個指標[16]。本實驗?zāi)Ｐ徒MALB水平較空白組顯著下降，給予紅曲茯苓片調(diào)節(jié)后，該指標含量較模型組顯著增加。說明體內(nèi)水液或濕邪偏重時，紅曲茯苓片可改善中醫(yī)濕盛證候，為脾虛濕盛證型研究的生化指標提供意見。ALD、VIP是參與水液代謝的重要激素[17]。脾虛濕盛模型大鼠ALD、VIP水平升高，可能與水液代謝紊亂相關(guān)，提示體內(nèi)濕邪偏盛，給予三個劑量組的紅曲茯苓片進行預(yù)防后，ALD、VIP水平均有不同程度的降低，高劑量組差異顯著，表明紅曲茯苓片有祛除機體水濕之邪、調(diào)節(jié)水液代謝作用。但血脂康對濕濁指標中ALB、ALD無明顯改善，說明復(fù)方對于改善濕盛癥狀效果更佳，復(fù)方中茯苓健脾滲濕、白術(shù)健脾燥濕，二者共同發(fā)揮祛濕的作用。水通道蛋白(AQPs)是參與體內(nèi)水液代謝的一類蛋白，對維持機體水代謝穩(wěn)態(tài)及細胞膜的水傳輸有著重要意義[18]，中醫(yī)認為“濕”即水液的一部分，因此，該指標可作為研究中醫(yī)與“濕”相關(guān)證候的基礎(chǔ)。結(jié)果表明模型組胃、腸組織AQP3表達量下降，血脂康組及紅曲茯苓片低、中、高劑量組均增加，模型組胃、腸AQP4表達量增加，血脂康組及紅曲茯苓片低、中、高劑量組AQP4水平基本下降，尤以血脂康組及紅曲茯苓片高劑量組更為明顯，說明AQP3、AQP4與紅曲茯苓片祛濕作用的機制關(guān)系密切。紅曲茯苓片改善腸組織AQP3水平優(yōu)于血脂康組，但血脂康組改善腸組織AQP4水平優(yōu)于紅曲茯苓片組，機制有待進一步研究。針對以上“濕濁”指標，通過本實驗研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)紅曲茯苓片在健脾基礎(chǔ)上，還可以通過抑制VIP水平，提高ALB活性，改善AQP蛋白含量，達到祛除濁邪的作用。

綜上，對脾虛濕盛型高脂血癥，紅曲茯苓片和血脂康都具有輔助降血脂功能，但紅曲茯苓片相比血脂康在健脾祛濕方面效果更加全面。既能有效調(diào)節(jié)脾胃運化、緩解脾胃虛弱，又能健脾祛濕，祛除濁邪。

隨著社會的進步，飲食結(jié)構(gòu)生活方式的改變，疾病譜和醫(yī)學(xué)模式發(fā)生了變化，人們的亞健康狀況日益增多，大健康理念深入人心，“辨證保健”是社會發(fā)展的大趨勢，將防治重心前移，在疾病早期根據(jù)人的體質(zhì)進行干預(yù)，精準保健，可防患于未然，中藥類保健食品所用原料與中成藥相比具有更高的安全性，其產(chǎn)品安全有效，適宜人群定位為疾病初期指標已顯異常、癥狀尚為輕淺的人群，符合保健的需求。本研究基于辨證保健的理念，采用高脂飼料喂養(yǎng)、飲食不節(jié)和游泳勞倦損傷脾氣復(fù)合因素造脾虛濕盛高脂血癥模型，研究紅曲茯苓片對功能、功效復(fù)合模型的降血脂作用和健脾，祛濕功效為精準保健，提高效果提供實驗依據(jù)，為進一步進行中醫(yī)辨證分型的人體試驗研究、評價提供借鑒。