周發(fā)英，彭澤艷，李玲

急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke，AIS）是造成我國(guó)居民致殘和死亡的主要原因之一，其發(fā)病率呈顯著上升趨勢(shì)[1]。研究顯示，機(jī)體炎癥反應(yīng)的激活是AIS 發(fā)生與進(jìn)展的重要因素[2]。因此，AIS 的免疫防治作為重要的治療手段，引起了廣泛關(guān)注。T 淋巴細(xì)胞是炎癥反應(yīng)激活的重要組成部分，作為炎癥反應(yīng)的上游調(diào)控因子，參與了眾多炎癥性疾病如冠心病、糖尿病等的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[3,4]。其中，輔助性T 細(xì)胞-17（T-helper-17，Th17）和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（T-Regulatory，Treg）是與炎癥性疾病發(fā)病及進(jìn)展相關(guān)的重要T 淋巴細(xì)胞亞群[5]。有研究顯示，機(jī)體Th17/Treg 細(xì)胞亞群失衡，可促進(jìn)下游炎性細(xì)胞因子合成及分泌顯著增加，引起器官持續(xù)性炎癥反應(yīng)及相應(yīng)器官功能損傷[6]。但在AIS 患者體內(nèi)Th17/Treg 細(xì)胞亞群與疾病病情嚴(yán)重程度及預(yù)后的相關(guān)性如何，目前尚未闡明。因此，本研究通過(guò)分析AIS 患者外周血Th17/Treg 細(xì)胞亞群及相關(guān)下游炎性通路水平的變化情況，探討外周血Th17/Treg細(xì)胞亞群與AIS患者病情嚴(yán)重程度及預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

連續(xù)收集2017年1月1日至2019年12月1日我院收治的AIS 患者190 例納入觀(guān)察組，其中男102 例，女88例；年齡62～86歲，平均年齡（73.6±9.8）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合AIS 的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；發(fā)病時(shí)間至入院時(shí)間＜24 h。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重肝、腎功能不全；合并腦出血；合并嚴(yán)重感染、自身免疫性疾病、惡性腫瘤等疾病。選擇同期門(mén)診行健康體檢者60例納入對(duì)照組。2組的性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、基礎(chǔ)疾病等差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。根據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院腦卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）評(píng)分將觀(guān)察組分為3 亞組，輕度亞組（NIHSS 評(píng)分≤4 分）61 例，中度亞組（NIHSS評(píng)分5～15分）64例，重度亞組（NIHSS評(píng)分≥l6 分）65 例。根據(jù)出院后3 個(gè)月改良Rankin 量表（modified Rankin Scale，mRS）評(píng)分對(duì)患者臨床預(yù)后進(jìn)行評(píng)估，mRS 評(píng)分0～2 分納入預(yù)后良好亞組，3～5 分為預(yù)后不良亞組。該研究方案獲得了本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并征得了患者及家屬書(shū)面知情同意。

1.2 主要設(shè)備及試劑

FACS 型流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)BD 公司。RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基、離子霉素、莫能霉素、佛波酯、淋巴細(xì)胞分離液、細(xì)胞固定液及細(xì)胞破膜劑購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-17、CD4 及CD25 單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Santa 公司；IL-17 和 轉(zhuǎn) 化 生 長(zhǎng) 因 子（transforming growth factor，TGF）-β酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)于中國(guó)武漢博士德生物公司。

1.3 方法

1.3.1 外周血Th17 和Treg 細(xì)胞亞群水平檢測(cè) 抽取入組患者入院第2日凌晨空腹靜脈血3 mL，經(jīng)肝素抗凝后，取抗凝血300 μL加入等體積的RPMI-1640培養(yǎng)基，接種于培養(yǎng)板，同時(shí)加入佛波酯（20 μL，1 μg/mL）、離子霉素（18 μL，40 μg/mL）及莫能霉素（20 μL，0.1 mg/mL），培養(yǎng)箱中孵育6 h。取100 μL 上述培養(yǎng)液，加入抗人CD4和CD25單克隆抗體10 μL，震蕩混勻后室溫避光孵育20 min，加入100 μL 細(xì)胞固定液。再次室溫避光孵育20 min 后，經(jīng)1500 g 離心5 min，棄上清后，加入100 μL 破膜液，同時(shí)加入IL-17 單克隆抗體10 μL 和Foxp3抗體10 μL，震蕩混勻后，待上機(jī)檢測(cè)。

1.3.2 外周血炎性指標(biāo)檢測(cè) 采用ELISA法測(cè)定患者外周血炎性指標(biāo)IL-17和TGF-β水平，具體操作依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0 軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布以及方差齊性的計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn)或單因素方差分析；相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析；運(yùn)用Graphpad 軟件做ROC 曲線(xiàn)分析，計(jì)算Th17及Treg細(xì)胞的ROC曲線(xiàn)下面積（AUC）、最佳工作點(diǎn)（OOP）、敏感性及特異性；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 觀(guān)察組與對(duì)照組間外周血Th17 和Treg 細(xì)胞亞群及相關(guān)炎性因子水平比較

觀(guān)察組外周血Th17、Th17/Treg 及IL-17 水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），Treg 細(xì)胞亞群和TGF-β水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.2 觀(guān)察組不同亞組間外周血Th17 和Treg 細(xì)胞亞群及相關(guān)炎性因子水平比較

重度亞組外周血Th17、Th17/Treg 比值及IL-17 水平明顯高于中度亞組和輕度亞組，中度亞組上述指標(biāo)顯著高于輕度亞組（P＜0.05）；重度亞組外周血Treg細(xì)胞亞群和TGF-β水平明顯低于中度亞組和輕度亞組，中度亞組上述指標(biāo)顯著低于輕度亞組（P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.3 不同預(yù)后亞組間外周血Th17 和Treg 細(xì)胞亞群及相關(guān)炎性因子水平比較

根據(jù)mRS 評(píng)分納入預(yù)后良好亞組139 例，納入預(yù)后不良亞組51 例。預(yù)后不良組亞患者外周血Th17、Th17/Treg 比值及IL-17 水平明顯高于預(yù)后良好亞組（P＜0.05），Treg 細(xì)胞亞群和TGF-β水平顯著低于預(yù)后良好亞組（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表1 觀(guān)察組與對(duì)照組間外周血Th17和Treg細(xì)胞亞群及相關(guān)細(xì)胞炎性因子水平比較（±s）

表1 觀(guān)察組與對(duì)照組間外周血Th17和Treg細(xì)胞亞群及相關(guān)細(xì)胞炎性因子水平比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，①P＜0.05

組別對(duì)照組觀(guān)察組例數(shù)60190 Th17/%2.12±0.879.85±1.24①Treg/%11.50±1.687.12±1.55①Th17/Treg 0.18±0.051.38±0.21①I(mǎi)L-17/(pg/mL)10.20±2.1631.05±5.88①TGF-β/(pg/mL)90.20±6.9060.12±5.34①

表2 觀(guān)察組不同亞組間外周血Th17和Treg細(xì)胞亞群及相關(guān)細(xì)胞炎性因子水平比較（±s）

表2 觀(guān)察組不同亞組間外周血Th17和Treg細(xì)胞亞群及相關(guān)細(xì)胞炎性因子水平比較（±s）

注：與輕度亞組比較，①P＜0.05；與中度亞組比較，②P＜0.05.

組別輕度亞組中度亞組重度亞組例數(shù)616465 Th17/%7.16±0.8310.15±0.92①13.18±1.04①②Treg/%8.50±0.757.06±0.60①5.98±0.55①②Th17/Treg 0.88±0.161.42±0.23①2.21±0.25①②IL-17/(pg/mL)25.30±4.3030.50±4.10①35.80±5.02①②TGF-β/(pg/mL)70.21±6.4259.80±5.28①50.44±5.51①②

表3 不同預(yù)后亞組間外周血Th17和Treg細(xì)胞亞群及相關(guān)細(xì)胞炎性因子水平比較（±s）

表3 不同預(yù)后亞組間外周血Th17和Treg細(xì)胞亞群及相關(guān)細(xì)胞炎性因子水平比較（±s）

注：與預(yù)后良好亞組比較，①P＜0.05

組別預(yù)后良好亞組預(yù)后不良亞組例數(shù)13951 Th17/%9.05±1.2011.40±1.28①Treg/%7.20±0.786.31±0.69①Th17/Treg 1.38±0.321.95±0.40①I(mǎi)L-17/(pg/mL)28.80±5.3133.58±5.88①TGF-β/(pg/mL)60.30±6.1053.10±6.40①

2.4 相關(guān)性分析

相關(guān)性分析顯示，AIS 患者外周血Th17 細(xì)胞水平與IL-17、NIHSS 評(píng)分和mRS 評(píng)分呈顯著正相關(guān)（r1=0.820，P＜0.001；r2=0.746，P＜0.001；r3=0.690，P＜0.001），與Treg 細(xì)胞水平和TGF-β呈顯著負(fù)相關(guān)（r1=－0.720，P＜0.001；r2=－0.658，P＜0.001）。

2.5 外周血Th17和Treg細(xì)胞對(duì)評(píng)估AIS患者預(yù)后不良的ROC曲線(xiàn)分析

繪制ROC 曲線(xiàn)，其結(jié)果顯示，外周血Th17 細(xì)胞水平的曲線(xiàn)下面積（AUC）為0.864（95%CI0.763～0.965），其最佳工作點(diǎn)（OOP）為11.28%，按此工作點(diǎn)對(duì)AIS 患者預(yù)后不良進(jìn)行預(yù)測(cè)，其敏感性和特異性分別為78.01%和82.50%。外周血Treg 細(xì)胞水平的曲線(xiàn)下面積（AUC）為0.818（95%CI0.713～0.923），其最佳工作點(diǎn)（OOP）為6.25%，按此工作點(diǎn)對(duì)AIS患者預(yù)后不良進(jìn)行預(yù)測(cè)，其敏感性和特異性分別為79.17%和74.50%，見(jiàn)圖1。

圖1 外周血Th17和Treg細(xì)胞的ROC曲線(xiàn)分析

3 討論

因人口老齡化，我國(guó)AIS 發(fā)生率呈現(xiàn)年輕化和逐年上升趨勢(shì)[8]。對(duì)于AIS病情及預(yù)后的評(píng)估，有重要的臨床意義。機(jī)體炎癥反應(yīng)的過(guò)度激活是AIS 發(fā)生、發(fā)展的重要的因素之一[9]。機(jī)體免疫功能紊亂可促進(jìn)炎癥反應(yīng)的激活，參與了AIS的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[10]。Th17細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞亞群，可通過(guò)分泌相應(yīng)炎性細(xì)胞因子，介導(dǎo)促炎反應(yīng)[11]。Treg 細(xì)胞也是CD4+T 細(xì)胞亞群之一，可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，抑制過(guò)度免疫反應(yīng)引起的組織細(xì)胞損傷[12]。在生理情況下，機(jī)體Th17和Treg細(xì)胞亞群維持在一定平衡狀態(tài)，當(dāng)受外在刺激作用下，該平衡狀態(tài)被打破，Th17 細(xì)胞活化顯著增加，Treg 細(xì)胞顯著減少，進(jìn)而促進(jìn)下游炎性細(xì)胞通路激活，產(chǎn)生炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[13]。相關(guān)研究顯示，Th17/Treg與炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可作為潛在的治療靶點(diǎn)[14]。在本研究中，隨著AIS患者病情嚴(yán)重程度的增加，外周血Th17 細(xì)胞及特異性分泌的IL-17 水平顯著升高，而外周血Treg 細(xì)胞及TGF-β水平顯著降低，提示Th17 與Treg 細(xì)胞亞群平衡的紊亂，促進(jìn)了下游炎性信號(hào)通路的激活，可能參與了AIS 患者病情的進(jìn)展。分析外周血Th17/Treg 與AIS 患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示，預(yù)后不良組外周血Th17 細(xì)胞和IL-17 顯著高于預(yù)后良好組，Th17 細(xì)胞水平與mRS 評(píng)分呈顯著正相關(guān)，而外周血Treg 細(xì)胞和TGF-β顯著低于預(yù)后良好組，提示外周血Th17/Treg 水平可有效的反映AIS 患者臨床預(yù)后。外周血Th17/Treg 細(xì)胞亞群的平衡失調(diào)引起AIS 的發(fā)生及進(jìn)展，可能與多種因素相互作用有關(guān)。有研究證實(shí)，外周血Th17 細(xì)胞通過(guò)分泌IL-17 可直接促進(jìn)低密度脂蛋白過(guò)氧化，損傷內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致內(nèi)皮素及炎性因子的進(jìn)一步釋放，促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化的形成，導(dǎo)致卒中的發(fā)生[15]。其次，IL-17 分泌增加，而TGF-β顯著減少，可激活體內(nèi)血小板，促進(jìn)血小板的黏附與聚集，導(dǎo)致血栓形成[16]，此外，外周血Th17/Treg 細(xì)胞亞群的平衡失調(diào)與心房顫動(dòng)的發(fā)生密切相關(guān)，間接影響了AIS的發(fā)生、病情進(jìn)展及預(yù)后[17]。通過(guò)有效調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞亞群的平衡，可顯著改善炎癥性疾病的進(jìn)展及預(yù)后[18]。Th17/Treg細(xì)胞亞群不僅與AIS病情嚴(yán)重程度及預(yù)后有關(guān)，還是AIS治療的潛在靶點(diǎn)。

綜上所述，外周血Th17/Treg細(xì)胞亞群與AIS的病情嚴(yán)重程度及預(yù)后密切相關(guān)。檢測(cè)外周血Th17/Treg細(xì)胞亞群，有助于評(píng)估AIS患者病情嚴(yán)重程度及預(yù)后。