吳飛，焦傳杰，楊越，劉豐，孫志博

丙戊酸是經(jīng)典的抗癲癇藥，本課題組前期研究顯示其具有神經(jīng)元保護(hù)作用[1,2]，并能有效地誘導(dǎo)大鼠脂肪源干細(xì)胞（adipose derived stem cells，ADSCs）向許旺細(xì)胞分化[3]，但其具體的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探討縫隙連接細(xì)胞間通訊在丙戊酸誘導(dǎo)ADSCs 向許旺細(xì)胞分化中的作用，以進(jìn)一步闡明其在神經(jīng)誘導(dǎo)中的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購于GIBCO公司，油酸酰胺、丙戊酸鈉、胰蛋白酶、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購于美國Sigma 公司，兔抗鼠神經(jīng)組織蛋白S100、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、巢蛋白（Nestin）、縫隙連接蛋白43（Connexin 43，Cx43）抗體購于Santa Cruz公司，RT-PCR試劑盒購于TOYOBO公司，2×Taq PCR MasterMix購于Fermentas公司，羊抗兔IgG、BCA蛋白濃度測定試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠ADSCs 的分離、培養(yǎng)、鑒定 取4 周齡SD大鼠10只，無菌取出適量的背部皮下脂肪，PBS漂洗，剪碎，用0.075% I 型膠原酶消化30 min，等量低糖DMEM 培養(yǎng)基終止消化，1500 r/min 離心10 min 后棄上清，以DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天換液1次，細(xì)胞接近融合狀態(tài)時，以0.25%胰酶消化、傳代，取第3 代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2 誘導(dǎo)大鼠ADSCs 向許旺細(xì)胞分化 以含10 ng/mL 堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）的培養(yǎng)液預(yù)誘導(dǎo)24 h，再用PBS 液漂洗，根據(jù)分組情況，將ADSCs分別用不含丙戊酸（A組）、含1.0 mmol/L丙戊酸（B組）、1.0 mmol/L丙戊酸+2.5 μmol/L油酸酰胺（C組）的誘導(dǎo)液培養(yǎng)7 d，每隔24 h換液。

1.2.3 MTT法檢測各組細(xì)胞增殖情況 調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/mL，接種至96孔板，每組各10孔。在24、48、72 h這3個時間點每孔各加入20 μL MTT溶液，孵育4 h離心后棄上清，加入150 μL DMSO，在波長490 nm 下使用酶聯(lián)免疫檢測儀記錄各孔吸光值。

1.2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 將ADSCs用4%多聚甲醛固定1 h，然后PBS 漂洗，3% 雙氧水甲醛浸泡15 min以滅活過氧化物酶；PBS 漂洗后滴入山羊血清封閉液10 min；再分別加入S100 一抗（1:500）、NSE 一抗（1∶500）、Nestin 一抗（1∶200）、Cx43 一抗（1∶200）后于4 ℃下孵育過夜；PBS 漂洗后加入生物素化二抗，37℃孵育1 h；SABC孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。封片后置于倒置顯微鏡下觀察。

表1 實時定量PCR引物序列

1.2.5 實時定量PCR 檢測 根據(jù)GenBank 公布的S100、NSE、Nestin 及Cx43 的cDNA 序列，采用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計引物序列，由Invitrogen公司合成，引物序列見表1。提取各組細(xì)胞的總RNA，行RT-PCR。然后行熒光實時定量反應(yīng)，結(jié)果表示為2（—△△Ct）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0 軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布以及方差齊性的計量資料以（±s）表示，組間比較采用方差分析及LSD檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs形態(tài)學(xué)觀察

原代培養(yǎng)6 h后顯微鏡下可見細(xì)胞貼壁生長，呈圓形分布；24 h后貼壁細(xì)胞變成短梭形，見圖1A；傳代后大部分細(xì)胞呈長梭形，增殖迅速，3 d后達(dá)85%融合，見圖1B、C。

圖1 大鼠ADSCs形態(tài)學(xué)觀察（光學(xué)顯微鏡，×200）

2.2 各組ADSCs增殖能力比較

MTT 檢測顯示，在3 個不同的時間點，3組細(xì)胞的增殖能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示2.5 μmol/L油酸酰胺無明顯的細(xì)胞毒作用，見圖2。

圖2 培養(yǎng)24、48、72 h后各組細(xì)胞增殖能力比較（MTT法）

2.3 各組S100、NSE、Nestin及Cx43蛋白表達(dá)水平比較

免疫細(xì)胞化學(xué)染色示，3組均有S100、NSE 和Nestin陽性細(xì)胞，B、C組S100、NSE、Nestin平均光密度值顯著高于A組（P＜0.01），C組低于B組（P＜0.01）；3組均有Cx43 陽性細(xì)胞，B、C組Cx43 平均光密度值顯著高于A組，B、C組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2、圖3。

表2 各組S100、NSE、Nestin及Cx43免疫細(xì)胞化學(xué)染色光密度值比較（±s）

表2 各組S100、NSE、Nestin及Cx43免疫細(xì)胞化學(xué)染色光密度值比較（±s）

注：與A組比較，①P＜0.01；與B組比較，②P＜0.01

組別A組B組C組例數(shù)555 S1000.1068±0.00980.2355±0.0224①0.1653±0.0183①②NSE 0.1352±0.01360.3176±0.0362①0.2158±0.0212①②組別A組B組C組Nestin 0.1613±0.01730.3578±0.0284①0.2361±0.0146①②Cx430.1206±0.01020.2102±0.0185①0.2031±0.0146①

圖3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測各組S100、NSE、Nestin、Cx43蛋白表達(dá)（光學(xué)顯微鏡，×200）

2.4 各組S100、NSE、Nestin 及Cx43 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平比較

實時定量PCR 檢測結(jié)果顯示，B、C組S100、NSE、Nestin mRNA 轉(zhuǎn)錄水平顯著高于A組（P＜0.01），C組低于B組（P＜0.01）；B、C組Cx43mRNA 轉(zhuǎn)錄水平顯著高于A組（P＜0.01），B、C組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3、圖4。

表3 各組S100、NSE、Nestin、Cx43 mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較（±s）

表3 各組S100、NSE、Nestin、Cx43 mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較（±s）

注：與A組比較，①P＜0.01；與B組比較，②P＜0.01

組別A組B組C組例數(shù)101010 S1001.00±0.105.86±0.52①2.46±0.31①②NSE 1.00±0.107.02±1.15①2.94±0.46①②組別A組B組C組Nestin 1.00±0.107.53±1.22①3.51±0.37①②Cx431.00±0.108.32±1.87①8.56±1.53①

圖4 實時定量PCR測定各組S100、NSE、Nestin、Cx43mRNA轉(zhuǎn)錄水平

3 討論

丙戊酸是一種廣譜抗癲癇藥，具有分子量小、易透過血腦屏障、人體吸收快、體內(nèi)有效血濃高、毒副作用少、價格低廉等優(yōu)點。研究發(fā)現(xiàn)丙戊酸可顯著促進(jìn)大鼠有髓神經(jīng)纖維再生[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)丙戊酸具有促雪旺細(xì)胞增殖和髓鞘化的類神經(jīng)營養(yǎng)特性[5]。與其他的神經(jīng)營養(yǎng)因子如神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)生長因子、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子相比較，丙戊酸具有快速通過血腦屏障、較長的生物半衰期及較高的臨床安全性等優(yōu)點。此外，本課題組以乳酸-羥基乙酸-L-賴氨酸多肽接枝聚/聚乳酸/納米羥基磷灰石作為載體復(fù)合丙戊酸，構(gòu)建可緩釋丙戊酸的神經(jīng)導(dǎo)管，成功地促進(jìn)了大鼠的外周神經(jīng)再生[6,7]。然而關(guān)于丙戊酸促進(jìn)神經(jīng)再生的作用機(jī)制目前尚不清楚。

縫隙連接廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，由細(xì)胞間的兩個半通道橋接組成，該通道由具有多肽鏈結(jié)構(gòu)的連接蛋白單體構(gòu)成。它傳遞著不同神經(jīng)細(xì)胞間的電化學(xué)信息，允許離子、代謝物、小分子物質(zhì)通過，對神經(jīng)發(fā)育及神經(jīng)功能維持具有重要的調(diào)控作用[8]?？p隙連接細(xì)胞間通訊經(jīng)常受到病理和藥物因素的影響，油酸酰胺作為常用的縫隙連接脫耦聯(lián)劑，能夠有效地抑制縫隙連接[9]。本研究應(yīng)用低濃度（2.5 μmol/L）的油酸酰胺來抑制縫隙連接通訊，MTT 試驗表明該濃度油酸酰胺對ADSCs 增殖未產(chǎn)生影響，無明顯細(xì)胞毒作用。

本實驗采用1.0 mmol/L 丙戊酸在體外誘導(dǎo)ADSCs 分化。免疫細(xì)胞化學(xué)和實時熒光定量PCR 檢測顯示B組細(xì)胞高表達(dá)許旺細(xì)胞特異標(biāo)記物S100、NSE 和神經(jīng)干細(xì)胞特異標(biāo)志物Nestin；經(jīng)油酸酰胺干預(yù)后C組細(xì)胞的S100、NSE、Nestin 表達(dá)水平顯著下調(diào)；而B組和C組的Cx43 表達(dá)均顯著增加；這提示丙戊酸可有效地誘導(dǎo)ADSCs分化為類許旺細(xì)胞，其作用能夠被油酸酰胺顯著抑制。

本研究創(chuàng)新性地指出縫隙連接細(xì)胞間通訊在丙戊酸誘導(dǎo)ADSCs神經(jīng)分化中的重要性，從基因和蛋白水平證實丙戊酸通過上調(diào)Cx43表達(dá)來誘導(dǎo)ADSCs向許旺細(xì)胞分化，該分化可被油酸酰胺干預(yù)顯著抑制，這提示油酸酰胺可能通過阻斷縫隙連接細(xì)胞間通訊抑制丙戊酸的神經(jīng)誘導(dǎo)分化作用。本研究中，丙戊酸明顯上調(diào)Cx43表達(dá)，油酸酰胺在抑制丙戊酸的誘導(dǎo)分化作用的同時對Cx43 表達(dá)卻沒有影響，這可能是通過影響Cx43的翻譯后修飾來發(fā)揮效應(yīng)，具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。