鄭 雪， 包安裕， 瞿 珍， 許婷婷， 謝松麗△

1武漢血液中心，武漢 4300302武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430060

在新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)疫情期間，武漢血液中心自2020年2月13日起開始執(zhí)行新冠肺炎康復(fù)者恢復(fù)期血漿的采集制備和發(fā)放任務(wù)，我中心承擔(dān)其中的制備工作，主要流程為分裝、病毒滅活及-30℃速凍。根據(jù)《新冠肺炎康復(fù)者恢復(fù)期血漿臨床治療方案(試行第二版)》的要求，新冠肺炎康復(fù)者血漿中具有治療價(jià)值的是IgG抗體[1]，且新冠肺炎病毒特異性IgG抗體是既往感染病毒的指示指標(biāo)，故本研究只討論血漿制備過程中的各種因素對(duì)IgG抗體滴度的影響。

由于新冠肺炎病毒核酸檢測(cè)可能存在假陰性或假陽性，因此結(jié)合血清特異性病毒抗體檢測(cè)有助于彌補(bǔ)核酸檢測(cè)不足，同時(shí)對(duì)流行病學(xué)調(diào)查和疾病診斷起到輔助作用。國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》對(duì)于確診病例增加了有關(guān)病毒特異性抗體檢測(cè)內(nèi)容，其中IgM抗體和IgG抗體同時(shí)陽性或血清IgG抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽性或恢復(fù)期較急性期4倍及以上升高可以作為確診病例的診斷依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

隨機(jī)選取2020年2月至3月在武漢血液中心無償捐獻(xiàn)血漿的新冠肺炎康復(fù)者50名，其中男性30名，女性20名，平均年齡37.4歲。首次捐獻(xiàn)者41名，第2次捐獻(xiàn)者9名。檢驗(yàn)科測(cè)定IgG抗體滴度大于1∶160的有38名，小于1∶160的有12名。留取捐獻(xiàn)者血漿病毒滅活前后的血漿樣辮，置于-20℃保存。

1.2 檢測(cè)方法

亞甲藍(lán)/光化學(xué)病毒滅活使用的是上海輸血技術(shù)有限公司生產(chǎn)的一次性使用病毒滅活輸血過濾器材和滅活柜。血漿辮在天商公司生產(chǎn)的天商-20℃冷庫中保存。IgG抗體滴度檢測(cè)由新波生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的2019-nCoV IgG抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，為科研試用試劑，使用其公司配套的型號(hào)為SuperFlex全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀進(jìn)行檢測(cè)分析。

采用SARS-CoV-2陰性血漿對(duì)50份滅活前后的血漿標(biāo)本進(jìn)行倍比稀釋，共設(shè)置了7個(gè)稀釋梯度，分別為1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560，吸取稀釋后樣本各10 μL分別上機(jī)檢測(cè)。使用磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)滅活前后的抗體滴度。使用同樣的方法對(duì)采集的血漿標(biāo)本在凍存前和-20℃凍存4個(gè)月后進(jìn)行SARS-CoV-2 IgG抗體滴度檢測(cè)。

抗體滴度≥1∶160的血漿標(biāo)本判定為合格標(biāo)本，抗體滴度<1∶160的血漿標(biāo)本判定為不合格標(biāo)本。記錄實(shí)驗(yàn)所得的化學(xué)發(fā)光量值，并轉(zhuǎn)換為抗體滴度等級(jí)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 22.0軟件對(duì)滅活前后、凍存前后的血漿標(biāo)本IgG抗體滴度進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 亞甲藍(lán)/光化學(xué)法滅活對(duì)IgG抗體滴度的影響

使用亞甲藍(lán)/光化學(xué)法滅活新冠肺炎康復(fù)者恢復(fù)期血漿，滅活前后的抗體滴度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

2.2 -20℃冰凍保存對(duì)IgG抗體滴度的影響

本研究中的樣本在捐獻(xiàn)者捐獻(xiàn)后即進(jìn)行IgG滴度檢測(cè)，將樣本置于-20℃冷庫保存4個(gè)月，再次檢測(cè)IgG抗體滴度，Wilcoxon配對(duì)秩和檢驗(yàn)顯示，凍存前后抗體滴度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

3 討論

新冠肺炎康復(fù)者恢復(fù)期血漿是患者在早期感染時(shí)激發(fā)體液免疫產(chǎn)生的針對(duì)病原的特異性抗體，康復(fù)后采集該患者的血漿所獲得的血漿制劑[2]。重癥患者輸注康復(fù)者恢復(fù)期血漿可以中和體內(nèi)感染病原，清除血液循環(huán)中的病原體以緩解病情[3]。2020年2月14日，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布文件《新型冠狀病毒肺炎重癥、危重癥病例診療方案(試行第二版)》，將輸注恢復(fù)期血漿治療作為一種特異性治療方案加以推廣，并對(duì)捐獻(xiàn)者抗體水平做出規(guī)范要求[4-5]。根據(jù)《新冠肺炎康復(fù)者恢復(fù)期血漿臨床治療方案(試行第二版)》相關(guān)規(guī)定，血漿IgG抗體滴度大于1∶160或總抗體滴度大于1∶320時(shí)可用于臨床重癥患者治療[4]，本研究中的50份血漿標(biāo)本中IgG抗體滴度合格(滴度大于1∶160)標(biāo)本38份，IgG抗體滴度不合格(滴度小于1∶160)標(biāo)本12份。

抗體滴度2、4、6分別代表1∶80、1∶320、1∶1280的滴度水平圖1 亞甲藍(lán)/光化學(xué)法滅活對(duì)IgG滴度的影響Fig.1 Influence of methylene blue/photochemical inactivation on IgG titer

抗體滴度2、4、6分別代表1∶80、1∶320、1∶1280的滴度水平圖2 血漿標(biāo)本凍存前后IgG抗體滴度的變化Fig.2 The change of IgG titer before and after plasma freezing

對(duì)血液制品進(jìn)行病毒滅活可采用多種方法，亞甲藍(lán)/光化學(xué)法滅活血漿病毒是近年來應(yīng)用的新技術(shù)，在國(guó)內(nèi)應(yīng)用最為廣泛，可使大多數(shù)的脂質(zhì)包膜病毒和部分的非脂質(zhì)包膜病毒滅活，特別是對(duì)HCV、HBV、HIV等病毒的滅活效果非常好。有研究顯示亞甲藍(lán)/光化學(xué)法可以高效滅活血漿中的脂包膜病毒，對(duì)SARS病毒也具有較強(qiáng)滅活作用[6]。我中心在制備新冠肺炎康復(fù)者恢復(fù)期血漿時(shí)，對(duì)每單位血漿都進(jìn)行了病原滅活，以確保輸注的安全性[7]。由于IgG抗體是一種糖蛋白，亞甲藍(lán)/光化學(xué)法主要作用于病毒核酸和脂包膜上[8]，故對(duì)血漿中抗體生物活性影響較小。本研究50份滅活前后樣本對(duì)比也證實(shí)了這一點(diǎn)。但其中有1份顯示滅活前滴度大于1∶2560，滅活后滴度降到1∶160。為了排除取樣和操作誤差，我們重新測(cè)試了一遍，結(jié)果與上述無差。我們又將此標(biāo)本原液和另外隨機(jī)4份標(biāo)本原液進(jìn)行了56℃ 30 min的熱滅活，此標(biāo)本滅活后IgG抗體滴度降至1∶1280，而其他4份標(biāo)本IgG抗體滴度未變。回顧性調(diào)查獻(xiàn)漿者捐獻(xiàn)資料，發(fā)現(xiàn)該獻(xiàn)漿者是4次捐漿中的第2次，第4次IgG抗體滴度檢測(cè)不合格。此特例情況未在其他文獻(xiàn)中找到可能原因，還需進(jìn)一步深入研究。

我中心在血漿滅活后還進(jìn)行了-30℃ 30 min速凍，并-20℃冷庫保存。目前有研究顯示，恢復(fù)期患者特異性血漿抗體在冰凍狀態(tài)下可以保持6個(gè)月到1年，或更長(zhǎng)時(shí)間[9]。在實(shí)際工作中，新鮮冰凍血漿有效期為1年，普通冰凍血漿保存有效期更長(zhǎng)，能保證血漿抗體的有效性。本研究顯示新冠康復(fù)者恢復(fù)期血漿的冰凍時(shí)間至少在4個(gè)月內(nèi)IgG抗體滴度無明顯衰減，但血漿中新冠特異性IgG抗體在冰凍保存條件下能保證臨床治療有效的最長(zhǎng)期限的準(zhǔn)確數(shù)據(jù)，還需要更多樣本來支持進(jìn)一步的研究。

以上研究可以初步判定我中心在新冠肺炎康復(fù)者恢復(fù)期血漿制備上流程合理，對(duì)血漿中IgG抗體的保存基本沒有負(fù)面影響。武漢作為曾經(jīng)是疫情最嚴(yán)重的國(guó)內(nèi)城市，積極響應(yīng)政府號(hào)召，仍在持續(xù)招募和采集新冠肺炎康復(fù)者恢復(fù)期血漿，希望在短時(shí)間內(nèi)能建立新冠恢復(fù)期血漿庫，以期在臨床的對(duì)癥治療，乃至疫苗研發(fā)和治療性抗體制備中發(fā)揮作用。