趙 琳， 朱爭艷， 朱宏飛， 徐元萍， 武華軍

武漢市第三醫(yī)院(武漢大學(xué)同仁醫(yī)院) 1藥學(xué)部 2婦科，武漢 4300603湖北省中醫(yī)院麻醉科，武漢430061

迄今為止，癌癥仍是全球范圍內(nèi)人類死亡的最主要原因之一，是世界性的問題，嚴(yán)重威脅著人類的健康及社會的發(fā)展。乳腺癌是全球女性中發(fā)病率及死亡率均居首位的惡性腫瘤[1]，在過去的30年里，雖然乳腺癌的臨床治療得到了顯著的改善，但仍是全球半數(shù)以上女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因[2]。因此，探討乳腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找新的藥物靶點(diǎn)，對乳腺癌新治療策略的提出具有重大意義。研究發(fā)現(xiàn)，人附睪蛋白4(human epididymis protein 4，HE4)在乳腺癌中呈高表達(dá)，可通過影響細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)和蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)信號通路促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[3]。而且，HE4在乳腺癌的發(fā)生及復(fù)發(fā)中具有診斷價值，可作為早期檢測和診斷乳腺癌的候選生物標(biāo)志物[4]。

利拉魯肽是一種新型降糖藥，而糖尿病與部分腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，研究顯示，利拉魯肽可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗乳腺癌的作用，可能與p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信號通路相關(guān)[5-6]。但利拉魯肽與乳腺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的關(guān)系并未完全明確，本研究將深入探討利拉魯肽是否通過HE4影響乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，并闡述其作用機(jī)制，為利拉魯肽臨床治療乳腺癌提供藥物靶點(diǎn)及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試劑 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞(中國科學(xué)院細(xì)胞庫)；利拉魯肽(諾和諾德制藥有限公司)；DMEM(美國Hyclone公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；二甲基亞砜(美國Sigma公司)；載體pSIREN(美國Addgene公司)；內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ(美國NEB公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)；SYBR Green PCR試劑盒(美國KAPA Biosystems公司)；Matrigel膠、Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)；兔抗HE4、兔抗Bad、兔抗Bcl-2和Caspase-3抗體(武漢Bioswamp)；兔抗PI3K、兔抗p-PI3K、兔抗AKT、兔抗p-AKT、兔抗ERK及小鼠抗p-ERK抗體(英國Abcam公司)。

1.1.2 儀器 倒置顯微鏡(德國Leica公司)；酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；熒光定量PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio Rad公司)；Transwell小室(美國康寧)；流式細(xì)胞儀(美國BECKMAN公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng) 將MCF-7細(xì)胞從液氮罐中取出，于37℃水浴中解凍，待凍存液完全融化后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。1000 r/min離心3 min，棄上清，加入1 mL DMEM懸浮細(xì)胞沉淀，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，再加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法篩選利拉魯肽半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50) 收集處于對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度后接種于96孔板中，每孔180 μL，約1×103個細(xì)胞，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁。加入不同濃度(0、10、50、100、500和1000 nmol/L)的利拉魯肽，培養(yǎng)24 h。加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去培養(yǎng)液上清，加入150 μL二甲基亞砜溶解液，振蕩10 min后，酶標(biāo)儀檢測490 nm處的吸光度(A)值，計(jì)算利拉魯肽干預(yù)MCF-7細(xì)胞的IC50。

1.2.3 si-HE4重組質(zhì)粒構(gòu)建 基于GenBank公布的HE4基因序列(NM_006103.3)，設(shè)計(jì)HE4干擾靶序列進(jìn)行合成，上游引物：5′-GATGAAATGCTGCCGCAAT-3′，下游引物：5′-TGACCAGA-ACTGCACGCAA-3′，陰性對照序列：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。采用內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切，使載體線性化，與目的基因片段連接，經(jīng)過陽性克隆鑒定后篩選出重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞。

1.2.4 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染24 h后，RT-PCR檢測MCF-7細(xì)胞中HE4表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)過程如下：提取細(xì)胞總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算HE4 mRNA相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 RT-PCR primer sequences

1.2.5 實(shí)驗(yàn)分組及處理 收集對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞，接種于12孔板中，每孔1 mL，約4×105個細(xì)胞。將細(xì)胞分為對照組、陰性對照(si-NC)組、si-HE4組、利拉魯肽組、si-HE4+利拉魯肽組。si-NC組和si-HE4組細(xì)胞分別進(jìn)行陰性對照質(zhì)粒和si-HE4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染；利拉魯肽組細(xì)胞則是采用IC50的利拉魯肽進(jìn)行干預(yù)；si-HE4+利拉魯肽組細(xì)胞經(jīng)過si-HE4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，再采用IC50利拉魯肽繼續(xù)干預(yù)。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移 在6孔板背后均勻畫橫線，橫穿過孔，每孔至少穿過5條橫線。每孔接種約1×106個細(xì)胞，培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞鋪滿孔板。第2天用無菌槍頭垂直于孔板背后的橫線劃痕，PBS洗去劃下的細(xì)胞，并加入無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。在0、24和48 h分別拍照，觀察細(xì)胞遷移情況。

1.2.7 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞侵襲 實(shí)驗(yàn)前24 h，將細(xì)胞培養(yǎng)于不含血清的培養(yǎng)液，進(jìn)行血清饑餓處理。采用PBS將24孔板和Transwell小室浸泡5 min，進(jìn)行濕潤。在小室中鋪設(shè)80 μL Matrigel(基質(zhì)膠)，在培養(yǎng)箱中放置30 min。消化細(xì)胞，PBS重懸后，將細(xì)胞密度稀釋到1×105個/mL，取0.5 mL細(xì)胞懸液接種于Transwell小室中，下層24孔板中加入750 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h。每孔中加入1 mL 4%多聚甲醛室溫固定15 min，棄去固定液，PBS洗滌，再加入1 mL 0.5%結(jié)晶紫溶液染色30 min，PBS洗滌并晾干。擦去Transwell小室中沒有穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞，于顯微鏡下拍照觀察細(xì)胞侵襲情況，并計(jì)數(shù)每個視野中的細(xì)胞數(shù)量。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集細(xì)胞，PBS洗滌后，消化細(xì)胞，待輕輕吹打可將貼壁細(xì)胞吹打下來時，停止消化。收集細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至離心管中，1000 r/min離心5 min，棄上清，PBS重懸細(xì)胞沉淀后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。取約5×105個細(xì)胞，1000 r/min離心5 min，棄上清，加入200 μL Binding buffer重懸細(xì)胞，再加入10 μL Annexin Ⅴ-FITC和10 μL PI，混勻后避光孵育30 min。加入300 μL Binding buffer后，于流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.9 Western blot檢測蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，以每孔20 μg蛋白上樣量進(jìn)行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，室溫封閉2 h。將膜分別放入加有HE4(1∶1000)、PI3K(1∶1000)、p-PI3K(1∶1000)、AKT(1∶500)、p-AKT(1∶1000)、ERK(1∶1000)、p-ERK(1∶10000)、Bad(1∶1000)、Bcl-2(1∶1000)、Caspase-3(1∶1000)、GAPDH(1∶1000)抗體的孵育盒中，室溫孵育1 h。用含0.05% Tween-20的PBS(PBST)洗滌3次后，加入按照1∶10000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行室溫孵育1 h。PBST洗滌3次后，加入化學(xué)發(fā)光試劑，并檢測各蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白與GAPDH的灰度值比作為其相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 利拉魯肽干預(yù)濃度篩選

MTT法檢測不同濃度利拉魯肽干預(yù)下的細(xì)胞活性，隨著利拉魯肽濃度的升高，細(xì)胞存活率降低(圖1)，計(jì)算得出利拉魯肽干預(yù)MCF-7細(xì)胞24 h的IC50為315.448 nmol/L，以該濃度為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中利拉魯肽組的干預(yù)濃度。

2.2 轉(zhuǎn)染效率檢測

si-HE4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h后檢測細(xì)胞中HE4 mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與對照組比較，si-HE4組HE4 mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見圖2，提示本研究轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)成功。

圖1 MTT檢測細(xì)胞存活率Fig.1 Detection of cells survival rates by MTT assay

與對照組比較，*P<0.05圖2 RT-PCR檢測細(xì)胞中HE4 mRNA的表達(dá)Fig.2 Detection of HE4 mRNA expression by RT-PCR

2.3 利拉魯肽與si-HE4對MCF-7細(xì)胞遷移的影響

隨著遷移時間的延長，與對照組比較，si-HE4組、利拉魯肽組及si-HE4+利拉魯肽組遷移細(xì)胞少，劃痕間距大，48 h時差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見圖3。提示利拉魯肽和沉默HE4均可抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞遷移。

2.4 利拉魯肽與si-HE4對MCF-7細(xì)胞侵襲的影響

與對照組相比，si-HE4組、利拉魯肽組及si-HE4+利拉魯肽組侵襲細(xì)胞數(shù)量均明顯減少(P<0.05)；與si-HE4組或利拉魯肽組比較，si-HE4+利拉魯肽組侵襲細(xì)胞數(shù)量亦明顯減少(P<0.05)，見圖4。提示利拉魯肽和沉默HE4均可抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞侵襲。

2.5 利拉魯肽與si-HE4對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響

與對照組相比，si-HE4組、利拉魯肽組及si-HE4+利拉魯肽組細(xì)胞凋亡率均明顯升高(均P<0.05)；與si-HE4組或利拉魯肽組比較，si-HE4+利拉魯肽組細(xì)胞凋亡率更高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見圖5。提示利拉魯肽和沉默HE4可誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡。

與對照組比較，*P<0.05；與si-HE4組比較，#P<0.05圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移(×100)Fig.3 Observation of cells migration by scratch test(×100)

1：對照組；2：si-NC組；3；si-HE4組；4：利拉魯肽組；5：si-HE4+利拉魯肽組；與對照組比較，*P<0.05；與si-HE4組比較，#P<0.05；與利拉魯肽組比較，&P<0.05圖4 Transwell小室實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞侵襲(×200)Fig.4 Observation of cells invasion by transwell chamber(×200)

2.6 利拉魯肽與si-HE4對MCF-7細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，si-NC組細(xì)胞中各蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，而si-HE4組、利拉魯肽組、si-HE4+利拉魯肽組細(xì)胞中HE4、p-PI3K、p-AKT、p-ERK、Bcl-2蛋白相對表達(dá)量均明顯降低(均P<0.05)，Bad和Caspase-3表達(dá)明顯升高(均P<0.05)；與si-HE4組或利拉魯肽組比較，si-HE4+利拉魯肽組HE4、cAMP、p-PI3K、p-AKT、p-ERK、Bcl-2蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低(均P<0.05)，Bad和Caspase-3表達(dá)進(jìn)一步升高(均P<0.05)。見表2和圖6。

1：對照組；2：si-NC組；3；si-HE4組；4：利拉魯肽組；5：si-HE4+利拉魯肽組；與對照組比較，*P<0.05；與si-HE4組比較，#P<0.05；與利拉魯肽組比較，&P<0.05圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率Fig.5 Detection of apoptotic rate by flow cytometry

表2 各蛋白表達(dá)水平比較Table 2 Comparison of protein expression

1：對照組；2：si-NC組；3：si-HE4組；4：利拉魯肽組；5：si-HE4+利拉魯肽組圖6 Western blot檢測蛋白表達(dá)Fig.6 Detection of protein expression by Western blotting

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，大量流行病學(xué)研究顯示，糖尿病與乳腺癌之間存在密切關(guān)聯(lián)[7-8]。利拉魯肽是一種通過DNA重組技術(shù)生成的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)受體激動劑，常用于臨床治療糖尿病[9]。據(jù)報道，利拉魯肽具有潛在的抗乳腺癌作用，研究顯示利拉魯肽可抑制MCF-7細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。但關(guān)于利拉魯肽抗乳腺癌的作用機(jī)制，目前并未完全闡述明確。HE4是具有免疫保護(hù)作用的蛋白酶抑制劑家族成員之一，在卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等腫瘤組織中高表達(dá)[3，11]。當(dāng)HE4低表達(dá)時，乳腺癌細(xì)胞增殖能力減弱，細(xì)胞凋亡增多，細(xì)胞移植瘤生長緩慢[12]，說明抑制HE4表達(dá)可望達(dá)到治療乳腺癌的效果?；谏鲜鲅芯繄蟮溃覀儾孪肜旊膶θ橄侔┑闹委熥饔每赡芘cHE4的表達(dá)水平有關(guān)，為驗(yàn)證此猜想，本研究使用IC50利拉魯肽干預(yù)乳腺癌細(xì)胞，觀察其與沉默HE4基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞生物學(xué)特征的影響。結(jié)果顯示，IC50利拉魯肽和沉默HE4基因均可抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗乳腺癌作用，兩者聯(lián)合處理后效果更顯著，而且IC50利拉魯肽干預(yù)乳腺癌細(xì)胞亦可降低HE4蛋白表達(dá)。

Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，該蛋白家族包括抗凋亡和促凋亡成員，其中抗凋亡成員包括：Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等，而促凋亡成員分為兩組，Bax組(包括：Bax、Bak和Bok)和BH3-only蛋白(包括Bad、Bim、Bid等)[13]。研究發(fā)現(xiàn)，Bad與Bcl-2均與細(xì)胞中線粒體凋亡途徑有關(guān)，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白間的相互作用改變線粒體通透性，控制著線粒體色素C(Cyt-c)等物質(zhì)從線粒體中釋放出來，通過線粒體途徑觸發(fā)Caspase凋亡反應(yīng)[14-15]。在本次研究中，利拉魯肽組和si-HE4組細(xì)胞中抗凋亡Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，而Bad和Caspase-3表達(dá)上調(diào)，且si-HE4+利拉魯肽組中蛋白表達(dá)差異更明顯。

在乳腺癌細(xì)胞中，PI3K/AKT/mTOR通路是最常見的失調(diào)途徑之一，該通路過表達(dá)和激活與癌細(xì)胞的生長及預(yù)后不良有關(guān)，被認(rèn)為是乳腺癌潛在的治療靶點(diǎn)[16]。Woo等[17]研究也證實(shí)了抑制PI3K/AKT/mTOR通路的激活，可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，且通路的抑制效果越好，對乳腺癌細(xì)胞發(fā)揮的抗腫瘤活性就越強(qiáng)。ERK磷酸化在細(xì)胞增殖和凋亡中的作用一直以來存在爭議，但相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，抑制乳腺癌細(xì)胞中AKT和ERK磷酸化可發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡的治療效果[18]。本次研究結(jié)果顯示，利拉魯肽和干擾HE4表達(dá)均可抑制乳腺癌細(xì)胞中PI3K、AKT及ERK的磷酸化水平，兩者聯(lián)合處理的抑制效果更強(qiáng)。

結(jié)合上述結(jié)果分析，提示利拉魯肽可能通過抑制乳腺癌細(xì)胞中HE4的表達(dá)，影響PI3K/AKT及ERK信號通路的激活，從而影響乳腺癌細(xì)胞的生物特性。本研究結(jié)果在前人研究的基礎(chǔ)上，從體外研究進(jìn)一步闡述了利拉魯肽對乳腺癌的治療機(jī)制，但還需通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深層次的驗(yàn)證。