李怡佳 邊艷超 李 碩 肖 瑞

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學內(nèi)蒙古自治區(qū)分子病理重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010059

男性不育是一種多因素病理狀況，影響全球約75%的男性。闡明男性不育遺傳機理的研究發(fā)現(xiàn)了許多關鍵途徑。例如，在性分化減數(shù)分裂過程中，由于減數(shù)分裂過程的復雜性，大量基因被認為參與了減數(shù)分裂過程的調(diào)控。這一過程中存在的缺陷可能導致減數(shù)分裂失敗、產(chǎn)生非整倍體配子和不育。非整倍體配子可以導致胚胎死亡或后代發(fā)育缺陷[1]。目前男性不育的臨床治療主要依靠輔助生殖技術，但其存在費用高、操作繁瑣以及高多胎率等一系列亟待解決的問題。因此，研究男性不育的發(fā)病機制并針對病因給予治療是今后的主要研究方向。本文對常見物理方法、化學方法、手術方法及基因敲除方法進行總結。

1 物理方法

1.1 熱刺激

哺乳動物中，睪丸溫度低于體溫的2～8℃是精子發(fā)生的前提條件[2]。睪丸溫度異常升高使代謝加快，需氧量增加，破壞平衡的氧化穩(wěn)態(tài)，致使精子損傷，導致不育。溫度越高，加熱時間越長，對生殖能力的損害越大。這種高溫誘發(fā)的精子損傷是可逆的。已有多篇文獻報道通過熱刺激來建立不育模型，處理的方法有水浴加熱、高溫照射、紅外線、激光等，考慮到可操控性及安全性，水浴加熱最為常用。

Hamilton 等[3]通過對公羊睪丸連續(xù)加熱288 h 并持續(xù)9 周收集精液后，發(fā)現(xiàn)精子運動性、活力和質量運動性均降低。在第5 周時，缺陷精子的數(shù)量顯著增加，具體表現(xiàn)在膜和頂體受損的精子百分比增加；完整的膜和頂體的精子百分比降低；完整的膜和受損的頂體精子百分比升高。Paul 等[4]發(fā)現(xiàn)公羊精子接受14 d或28 d 的熱刺激后可觀察到頂體和質膜損傷。但從第6 周開始，實驗組的公羊精子與未受熱刺激的公羊精子比較，差異無統(tǒng)計學意義（P >0.05），提示精子的損傷程度與熱刺激的時間和溫度呈正相關，但在一定程度上是可逆的。這可能是因為熱刺激后公羊睪丸中的抗氧化劑（HMOX1、GPX1 和GSTA）表達增強，氧化應激失衡導致的氧化穩(wěn)態(tài)被破壞[3]，這種損傷會持續(xù)約1 個精子周期（47 d）。

劉安娜等[5]收集了71 例高溫環(huán)境男性工作者（廚師、電焊工、鍋爐工）的精液進行對照研究，發(fā)現(xiàn)長期暴露于高溫環(huán)境中，男性的精子密度、精子活率明顯下降，精子畸形率明顯升高，且暴露時間越長，癥狀越明顯。持續(xù)高溫導致睪丸內(nèi)環(huán)境和生精微環(huán)境改變，造成生精細胞脫落、曲細精管萎縮。隨著熱暴露時間的延長，附睪精子出現(xiàn)胞漿小滴，精子運動速度增快，未成熟精子被排出，并產(chǎn)生失活精子和各種畸形精子。Rao 等[6]將兩組試驗者以不同頻率在43℃水中進行水浴。通過觀察發(fā)現(xiàn)試驗者精子密度及總精子數(shù)均明顯降低，精子運動性、低滲腫脹試驗評分和總頂體酶活性增加，但其是可逆的。與連續(xù)熱暴露比較，反復間歇性熱暴露更嚴重地抑制精子發(fā)生，具體表現(xiàn)在恢復時間更長，程度更重，這可能是由于間歇性熱暴露會在精子發(fā)生的多個階段產(chǎn)生影響。

1.2 輻射效應

男性生殖細胞對電離輻射、輻射熱及有毒物質敏感。經(jīng)X 線照射的小鼠睪丸組織中[7]可觀察到睪丸組織、生殖細胞的形態(tài)，DNA 含量均發(fā)生變化。經(jīng)X 線照射后小鼠睪丸重量減輕，睪丸生精小管內(nèi)精原細胞和初級精母細胞變性壞死，細胞質減少、核固縮，細胞膜破裂，壞死脫落。生精小管形狀不規(guī)則，管腔間隙增大,生精細胞層數(shù)明顯減少，管腔內(nèi)成熟精子占比減少甚至消失。精子及生精細胞DNA 鏈發(fā)生斷裂，影響生精功能。

Zhang 等[8]將小鼠精母細胞衍生的GC-1 細胞暴露于環(huán)境射頻場和X 線中發(fā)現(xiàn)，共同照射下的細胞較單獨暴露于X 線的細胞增殖水平顯著降低并且凋亡率顯著增加，Bcl-2 蛋白表達水平顯著降低以及Bax 蛋白表達增高，可觀察到生精小管的結構、精子形態(tài)及數(shù)量和抑制生殖細胞增殖等方面的改變。提示Bcl-2 和Bax 可能參與輻射誘導生精細胞凋亡的機制，環(huán)境射頻場雖然不會對男性生殖能力有影響，但可加劇X 線誘導的細胞抑制增殖。

2 化學方法

2.1 化療藥物

近幾十年來，化療藥物的發(fā)展使癌癥患者的存活率急劇上升，但也因此出現(xiàn)生育問題。環(huán)磷酰胺（CTX），順鉑（CIS）和多柔比星（DOX）是臨床常用抗癌藥物。這些藥物通過對生發(fā)上皮內(nèi)特定細胞的選擇性損傷，阻礙精子成熟障礙，損傷支持細胞或上皮樣間質細胞等，使正常的微環(huán)境受到破壞，影響精子產(chǎn)生。已有研究[9]顯示青春前期的孩童接觸這些化療藥物會影響生育能力，幸存的男性受孕概率降低，且單獨和聯(lián)合使用藥物差異無統(tǒng)計學意義（P >0.05），女性妊娠的可能性及活產(chǎn)率均明顯降低。

Smart 等[10]發(fā)現(xiàn)將青春前期小鼠睪丸組織碎片分別培養(yǎng)于臨床治療濃度的CTX 活性代謝物磷酰胺芥末、CIS 及阿霉素中，觀察到這3 種藥物均導致小鼠睪丸組織中包括精原干細胞在內(nèi)的生殖細胞特異性及顯著性喪失，但體細胞沒有受影響。暴露于高濃度CTX 和DOX 中，95%的小管缺乏生殖細胞或大量細胞壞死；高濃度CIS 組在此基礎上同時并有生精小管的直徑減小。很多學者研究了大量化療藥物對青春后期嚙齒類動物的性腺毒性，結果表明暴露于CTX、CIS、DOX 均導致精原細胞及精母細胞數(shù)量降低，并且CTX 不僅造成精原干細胞的死亡，存活干細胞中產(chǎn)生的精子也可能表現(xiàn)出一定程度的功能和DNA損傷[11]。

2.2 棉酚

魚精蛋白是成熟精子的主要核蛋白，其主要作用是濃縮精子細胞核，保護精子遺傳信息，通過組蛋白-魚精蛋白取代反應使精子細胞核高度濃縮[12]。醋酸棉酚能夠破壞曲細精管中的精子細胞和精母細胞，干擾大鼠HPRR 及精核蛋白含量，抑制精子的發(fā)生過程，在大部分臨床不育患者中均存在HPRR 及精核蛋白異常。

Santana 等[13]研究顯示，棉酚會對精子運動及形態(tài)產(chǎn)生影響。大鼠灌胃給藥劑量為5 mg/kg 的棉酚乙酸混合液，實驗組大鼠的后代數(shù)量為零，附睪精子數(shù)量減少，谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著增加，睪丸中GSH 的濃度顯著降低。El-Sharaky 等[14]對大鼠注射不同劑量的棉酚乙酸混合液，各劑量組大鼠生育能力均被影響，精子呈現(xiàn)不同程度的形態(tài)異常及運動性降低，睪丸間質細胞和支持細胞被完全破壞，精子數(shù)量減少，濃度降低。同時大鼠肝臟組織病理切片存在亞急性或慢性肝損傷。棉酚損傷動物模型對臨床用藥劑量的選擇有重要意義，適當劑量不僅能將藥物的副作用減弱，也能減少對其他組織臟器的損傷。

2.3 雷公藤多苷

雷公藤多苷干擾大鼠睪丸初級精母細胞DNA 合成，使睪丸萎縮，各級生精細胞變性、壞死、數(shù)量減少，其中以精子、精母細胞和次級精母細胞最敏感；附睪精子畸形率顯著提高，精子頭尾分離、無鉤、頸尾彎曲、無定形現(xiàn)象顯著增多[15]，但低劑量雷公藤多苷的作用是可逆的。

按30 mg/kg 的劑量灌胃SD 大鼠8 周[16]后大鼠精子密度及活性顯著降低，精子細胞質和線粒體Ca2+含量顯著降低，經(jīng)治療30 d 后顯著恢復。以30、40、50 mg/kg 劑量的雷公藤混懸液分別灌胃SD 大鼠3～5 周后，大鼠睪丸的質量、精子計數(shù)、精子活動率以及睪丸組織Makler 評分（testicular Makler score，TMS）隨劑量或灌胃時間的增加而持續(xù)降低。停藥后，低、中劑量組指征略有恢復；50 mg/kg 組未見恢復。給予雌性昆明小鼠50 mg/kg 雷公藤多苷后[17]可觀察到小鼠的發(fā)情期時長增加，但發(fā)情頻率顯著降低，雌性小鼠子宮內(nèi)膜變薄，并誘導卵巢早衰。

2.4 腺嘌呤

腺嘌呤在動物實驗中通常是用來誘發(fā)慢性肝、腎功能損害模型。在腺嘌呤誘導的慢性腎損傷早期Wistar 大鼠[18]中發(fā)現(xiàn)腺嘌呤通過抑制17β-羥基類固醇氧化還原酶產(chǎn)生抑制睪酮的合成。連續(xù)30 d 對大鼠灌胃200 mg/kg 劑量的腺嘌呤[19]，觀察到大鼠的交配數(shù)量并使交配潛伏期延長，且睪丸重量減少，精子密度和精子活力降低以及睪丸中的酸性磷酸酶（ACP）、琥珀酸脫氫酶（SDH）、乳酸脫氫酶（LDH）和γ-谷氨酰轉肽酶（γ-GT）活性降低，經(jīng)果糖二磷酸鍶鹽治療后可恢復。

3 手術方法

3.1 實驗性隱睪

Li 等[20]對10 日齡的昆明小鼠進行誘導隱睪手術35 d 后發(fā)現(xiàn)精液中僅存在精原細胞和初級精母細胞，提示隱睪可能使精子的發(fā)育停滯在初級精母細胞階段。對小鼠進行單側隱睪手術[21]，兩側對比效果更為明顯。手術側全部生精小管均顯示出萎縮和塌陷，在生發(fā)上皮中存在嚴重的退行性變化，并且所有階段都未出現(xiàn)晚期生殖細胞。

隱睪癥的手術誘導模型是經(jīng)常被用作研究睪丸組織熱應激的模型[22]，提示隱睪癥導致小鼠生育能力的降低機制與熱應激相似，都與高溫引起的抗氧化酶活性下降有關。

3.2 手術致精索靜脈曲張

精索靜脈曲張一直被認為是導致男性不育的原因之一。Saypol 等[23]對大鼠和狗進行了精索靜脈曲張實驗，術后大鼠和狗的睪丸血流量增加，睪丸溫度升高，需氧量上升，成熟精子生精小管百分比下降，睪丸生殖細胞凋亡程度加重，同時睪丸萎縮。

4 遺傳因素

4.1 X 線修復交叉互補組1（Xrcc1）基因敲除

Xrcc1 是一種重要的DNA 修復基因，在精子發(fā)生早期高度表達[24]，以維持基因組穩(wěn)定性。Xrcc1 基因敲除小鼠與野生型小鼠比較，睪丸體積更小，精子濃度降低且精子活性減弱；生精小管數(shù)量減少，管壁層數(shù)缺失和上皮細胞紊亂。Xrcc1 缺乏會誘導睪丸活性氧水平升高，線粒體功能障礙，使細胞凋亡、損害精子和喪失精原干細胞。Xrcc1 敲除的精原干細胞體外實驗發(fā)現(xiàn)抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸孵育細胞24 h 可以部分逆轉損傷，但不能恢復生育能力或改善細胞凋亡。

4.2 雄激素受體（AR）基因敲除

雄激素和AR 促使睪丸發(fā)揮正常生理功能，在小鼠睪丸體細胞及精子細胞中廣泛表達，缺乏則會發(fā)生睪丸女性化綜合征。AR 基因特異性敲除小鼠生殖細胞發(fā)育不完整并伴有數(shù)目減少分裂遲緩，血清睪酮水平降低，從而導致無精子癥及不育[25]。敲除小鼠睪丸中雖然仍有正常生殖細胞，但AR 基因敲除致使某些基因不能正常表達，難以維持支持細胞生理功能和管周肌樣細胞正常收縮，影響正常的精子發(fā)生和排出[26]。

4.3 Piwi 基因突變

Piwi 基因最早在果蠅卵巢中被發(fā)現(xiàn)，以維持生殖系干細胞（GSC）發(fā)育。在小鼠睪丸中3 個Piwi 同源基因均表達，且都與雄性生育能力有關[27]。Gou 等[28]在脊椎動物Piwi 蛋白的N 端結構域中發(fā)現(xiàn)了一個保守的破壞框（D-box），在小鼠精子發(fā)生晚期，Miwi 蛋白依賴D-box 被泛素化和降解[29]。

在特異性D-box 突變敲入小鼠中[30]，Miwi 蛋白水平升高，表現(xiàn)為雄性全部不育，而雌性均表現(xiàn)出正常的生育能力。雄性突變小鼠睪丸平均重量降低25%，精子數(shù)量減少，喪失運動能力，且形態(tài)異常，大多數(shù)表現(xiàn)為向背彎曲。精子染色質壓縮較少，只在晚期精子細胞中觀察到廣泛凋亡信號。Miwi D-box 區(qū)域缺陷更為嚴重。敲入小鼠Miwi 蛋白水平的升高，會直接抑制泛素連接酶的活性，晚期精子細胞中Miwi 蛋白無法被降解，組蛋白與魚精蛋白交換不完全，精子功能受損[31]。

5 總結

不育人數(shù)逐年上升，且有高達30%～40%的患者病因不明。利用動物模型深入了解男性不育的病因和潛在的分子機制將為臨床治療提供依據(jù)。

在眾多造模方法中，化學方法最為經(jīng)濟、快捷、簡便，是目前研究機制較為成熟且適用最廣的。但其缺點在于，有些化學藥物對實驗動物的臟器有損傷，且部分化學藥物的使用劑量沒有統(tǒng)一的定論，使得成模率降低，造模死亡率上升。物理造模方法操作簡單，并且損傷部位針對性強，但是損傷程度不夠徹底，部分方法模型生殖能力會主動恢復，不夠穩(wěn)定?；蚯贸m然指向性明確，但成本高昂，操作難度大，難以廣泛使用。手術方法造模，病變部位明確，與其他方法比較，不會造成其他臟器的損傷。這些造模方法各有優(yōu)劣，研究者可根據(jù)實驗目的和實驗室條件選擇合適的造模方法，為男性不育的臨床診治提供研究基礎。