袁 景，郭從容，馬菲妍,2*，尚慶麗，馬景學(xué)

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 眼科，河北 石家莊050000;2.深圳市新產(chǎn)業(yè)眼科新技術(shù)有限公司)

視網(wǎng)膜色素上皮(Retinal Pigmented Epithelium，RPE)細(xì)胞是位于視網(wǎng)膜光感受器底層的單層上皮細(xì)胞，其細(xì)胞膜具有選擇透過性。RPE細(xì)胞的主要功能是將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子從脈絡(luò)膜毛細(xì)血管轉(zhuǎn)運(yùn)至光感受器，起到血眼屏障的作用;吞噬視網(wǎng)膜代謝終產(chǎn)物、消化光感受器外節(jié)膜盤并生成新的膜盤，從而保證光感受器的正常功能;促進(jìn)損傷后的再生和修復(fù)[1]。這些功能的異?？蓪?dǎo)致視網(wǎng)膜變性、光感受細(xì)胞死亡，最終導(dǎo)致視力喪失。RPE細(xì)胞中的黑色素對(duì)其周邊結(jié)構(gòu)有重要的保護(hù)作用，它可吸納光感受細(xì)胞無法吸收的多余光，保護(hù)視網(wǎng)膜免受光產(chǎn)生的氧活性物質(zhì)的影響。但RPE細(xì)胞中的黑色素不可再生，隨著光照、年齡等因素的影響逐漸累積，RPE則會(huì)表現(xiàn)出異常[2]。因此，對(duì)RPE細(xì)胞中的黑色素的定性定量檢測(cè)有助于提早發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜相關(guān)病變。

1 基于LED光源的眼底成像系統(tǒng)

1.1 彩色眼底照相(Fundus Color Photography，CFP)

眼底照相是一種傳統(tǒng)的臨床成像方式，產(chǎn)生視網(wǎng)膜的二維、正面彩色圖像，大多數(shù)現(xiàn)代臺(tái)式眼底系統(tǒng)的視野約為 45°，不需要散瞳。眼底系統(tǒng)的基本組成部分是白光光源，照明路徑中有中央環(huán)形遮擋片、物鏡、變焦鏡頭，以及用于檢測(cè)圖像的攝像機(jī)。環(huán)形孔徑可在瞳孔處形成環(huán)形照明模式，在視網(wǎng)膜處形成環(huán)形照明模式，并在攝像機(jī)處檢測(cè)到圓形圖像。瞳孔處的環(huán)形照明模式減少了來自角膜的反向反射，并允許更好地檢測(cè)來自視網(wǎng)膜的反射光。照明和收集路徑可以與分光器或帶中心孔的鏡子結(jié)合，在傳輸收集光的同時(shí)使照明路徑偏轉(zhuǎn)[2]。

彩色眼底照相是臨床初步診斷中的基本檢查，部分疾病的臨床分級(jí)是依據(jù)眼底彩色照相進(jìn)行的，例如年齡相關(guān)性黃斑變性(Age-related macular degeneration，AMD)，眼底照相中脫色素改變或色素堆積改變是其分級(jí)中的評(píng)估指標(biāo)之一[3]。但彩色眼底照相的弊端是無法區(qū)分RPE細(xì)胞色素改變和脈絡(luò)膜色素改變，并且無法定量檢測(cè)。為了能夠定量檢測(cè)色素，在彩色眼底照相的基礎(chǔ)上發(fā)明出眼底反光測(cè)量?jī)x。

1.2 眼底反光測(cè)量?jī)x

眼底反射測(cè)定法基于視網(wǎng)膜光密度計(jì)測(cè)量(retinal densitometer)，該儀器由光源、改變?nèi)胙壅丈涔獠ㄩL(zhǎng)的濾光片、可定量檢測(cè)視網(wǎng)膜反光的檢測(cè)器(光電倍增管)組成[4]。拍攝過程中先利用高強(qiáng)度白光漂白視網(wǎng)膜后，以較低光強(qiáng)的特定光譜(例如500 nm)進(jìn)行二次照射，反射光的強(qiáng)度量化后可評(píng)估眼底色素的光密度強(qiáng)度。

眼底反光測(cè)量?jī)x目前主要用于定量評(píng)估黃斑色素，包括視錐色素、視紫紅質(zhì)和黑色素[5]。但眼底反光測(cè)量?jī)x并未在臨床中推廣使用，主要原因是其測(cè)量計(jì)算模型復(fù)雜、結(jié)果的穩(wěn)定性和一致性較差。導(dǎo)致結(jié)果穩(wěn)定性和一致性較差的主要原因是由于屈光介質(zhì)混濁以至于發(fā)生不同程度散射，以及不同層次組織的吸收程度變異較大。除此以外，眼底反光測(cè)量?jī)x的結(jié)果輸出為數(shù)字，僅有少數(shù)模型可以形成二維平面圖，臨床解讀較困難，因此未能在臨床上推廣使用。

2 共聚焦掃描激光檢眼技術(shù)

掃描激光檢眼鏡(Scanning laser ophthalmoscopy,SLO)的出現(xiàn)為眼底熒光造影、自發(fā)熒光成像、廣角成像(wide-field SLO)、自適應(yīng)光學(xué)SLO奠定了基礎(chǔ)。SLO最早由Webb 團(tuán)隊(duì)報(bào)道于1981年，并隨后發(fā)展為共聚焦掃描激光檢眼技術(shù)[6]。其成像原理是在視網(wǎng)膜上投射低功率激光光束，以光柵(raster)方式對(duì)眼底進(jìn)行掃描，具有成像快、分層掃描等優(yōu)點(diǎn)，可以在非接觸情況下實(shí)現(xiàn)200°視網(wǎng)膜成像[7]。視網(wǎng)膜各個(gè)點(diǎn)位的反射信號(hào)可通過共焦針孔后被探測(cè)器記錄，生成二維圖像。離焦光束信號(hào)在成像過程中被抑制，因此，圖像的對(duì)比度得到增強(qiáng)、性噪比較優(yōu)。這種對(duì)離焦光束的抑制程度隨著離焦的程度成比例，尤其是來自于晶狀體或角膜的信號(hào)源受到顯著信號(hào)抑制，所以可有效減少晶狀體和角膜干擾、降低光線在眼內(nèi)的散射，成像清晰度高、對(duì)比度好[8]。SLO技術(shù)逐步融入其他技術(shù)模塊(如眼追蹤技術(shù))，形成了高清眼底熒光造影、藍(lán)光自發(fā)熒光、近紅外自發(fā)熒光等組合成像方式。以下將從針對(duì)RPE細(xì)胞中色素成像角度進(jìn)行梳理。

2.1 近紅外自發(fā)熒光(Near-infrared autofluorescence imaging,NIR-AF)

在2006年由世界氣象組織主辦的山洪預(yù)報(bào)國(guó)際研討會(huì)上，與會(huì)人員提出開發(fā)一套適合全球應(yīng)用的山洪預(yù)警系統(tǒng)。目前，山洪預(yù)警系統(tǒng)（FFG system）正在通過一系列區(qū)域性項(xiàng)目在一些國(guó)家和地區(qū)推廣應(yīng)用。已經(jīng)實(shí)施的項(xiàng)目分布在中美、南非、黑海和中東等地區(qū)，一個(gè)原型系統(tǒng)已經(jīng)自2011年在巴基斯坦開始運(yùn)行。其應(yīng)用的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)是利用美國(guó)衛(wèi)星可獲得的衛(wèi)星降雨估算場(chǎng)、數(shù)字高程模型、遙感影像數(shù)據(jù)和地理信息系統(tǒng)。基于這些數(shù)據(jù)，可進(jìn)行小流域基礎(chǔ)信息提取和降雨徑流分析計(jì)算。

眼底自發(fā)熒光(Autofluorescence，AF)是一種可以反映RPE代謝活力的檢測(cè)工具，它能顯示RPE細(xì)胞中脂褐質(zhì)及發(fā)生在神經(jīng)視網(wǎng)膜層下和外層視網(wǎng)膜疾病中的熒光團(tuán)的分布情況。根據(jù)眼底發(fā)光體的不同，眼底自發(fā)熒光有幾種類型，目前已經(jīng)研究明確的主要有兩種，即脂褐質(zhì)相關(guān)藍(lán)光自發(fā)熒光(Fundus Autofluorescence，F(xiàn)AF)和黑色素相關(guān)NIR-AF，前者是依賴于RPE細(xì)胞中的脂褐質(zhì)中的雙重類視色素(bisretinoids)的一種熒光形態(tài)，后者主要是來源于RPE層細(xì)胞中和脈絡(luò)膜層中的黑色素顆粒，Piccolino等人在1996年的一項(xiàng)研究中首次用捕捉到了視網(wǎng)膜中黑色素在近紅外光中的自發(fā)熒光信號(hào)[9]。NIR-AF近年來成為大家研究的熱點(diǎn)，該熒光的激發(fā)波長(zhǎng)為795 nm，濾過波長(zhǎng)為800 nm，其發(fā)射光經(jīng)計(jì)算機(jī)處理數(shù)據(jù)后，可以將RPE細(xì)胞內(nèi)黑色素的分布情況描繪出來，其受RPE層前自發(fā)熒光材料物質(zhì)以及吸光度的影響，基于這些特性，NIR-AF是一種研究外層視網(wǎng)膜的很好的非侵入性的影像工具。

NIR-AF可用于AMD各期病變觀察，例如早期AMD地圖樣萎縮，也可用于視網(wǎng)膜變性疾病，包括視網(wǎng)膜色素變性、魚雷樣黃斑病變、Best卵黃樣黃斑病變、Stargardt 病、炎癥相關(guān)改變?nèi)缫贿^性白點(diǎn)綜合征、Vogt-Koyanagi-Harada病等[10-11]。但NIR-AF明顯的弊端為軸向分辨率差，無法對(duì)色素的三維分布進(jìn)行成像，RPE細(xì)胞的黑色素和脈絡(luò)膜黑色素?zé)o法分離、信號(hào)疊加，無法在不同患者的NIR-AF圖中實(shí)現(xiàn)色素濃度定量測(cè)量[12]。

2.2 熒光壽命成像(Fluorescence lifetime imaging ophthalmoscopy,FLIO)

熒光壽命定義為視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜中自發(fā)熒光信號(hào)和熒光物質(zhì)被激發(fā)后熒光信號(hào)持續(xù)的時(shí)間，熒光壽命測(cè)量反映的是分子受到光脈沖激發(fā)后返回基態(tài)之前在激發(fā)態(tài)平均停留的時(shí)間[13]。眼內(nèi)黑色素家族是由真黑色素(Eumelanin)和嗜鎘黑色素(pheomelanin) 組成。真黑色素在棕眼人群中更普遍，嗜鎘黑色素在藍(lán)眼睛或綠眼睛人群中更多見。黑色素的熒光衰減較復(fù)雜，其熒光壽命短則持續(xù)數(shù)皮秒，長(zhǎng)可持續(xù)至8納秒。細(xì)胞中的黑色素、脂褐素及黑色脂褐素顆粒具有十分活躍的自由基，被可見光或紫外線照射后易被激活，在氧化狀態(tài)下，黑色素的激發(fā)光為450 nm-470 nm，發(fā)射波長(zhǎng)540 nm[14]。目前FLIO主要應(yīng)用于激光眼底損傷、視網(wǎng)膜色素變性、中心性漿液性視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜病變、Stargardts病等疾病的影像學(xué)輔助診斷[15]。

2.3 自適應(yīng)光學(xué)掃描激光檢眼鏡(AdaptiveOptics，AO)

人眼內(nèi)部存在像差，人眼像差的測(cè)量依賴于基于Hartmann-Shack原理設(shè)計(jì)的波前像差感測(cè)器，像差的測(cè)量結(jié)果可通過可變形鏡面進(jìn)行校準(zhǔn)，其中可變形鏡面由其背面大量推動(dòng)桿(電子控制)進(jìn)行調(diào)整，調(diào)整精度可達(dá)到2 μm。因此將波前像差校準(zhǔn)技術(shù)與現(xiàn)有的光學(xué)成像技術(shù)相融后，即形成“自適應(yīng)光學(xué)”。自適應(yīng)光學(xué)成像可達(dá)到細(xì)胞水平的清晰度，且無創(chuàng)。自適應(yīng)光學(xué)成像過程中，對(duì)于病變位置進(jìn)行掃描，其反射光經(jīng)過人眼屈光系統(tǒng)的折射發(fā)生方向偏移，進(jìn)入波前像差感測(cè)器后反射光的偏移量可對(duì)可變形鏡面進(jìn)行調(diào)整，并對(duì)人眼的像差進(jìn)行屈光補(bǔ)償，此過程反復(fù)循環(huán)，直至眼球像差校正至近衍射極限水平，同時(shí)采用另外一個(gè)光源(非相干光)進(jìn)行閃光拍照，并記錄在眼底照相或掃描機(jī)光檢眼鏡中[16]。

目前自適應(yīng)光學(xué)可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞水平成像，呈現(xiàn)色素上皮層的六角形結(jié)構(gòu)，可直接觀察色素上皮細(xì)胞的形態(tài)，其原理決定其成像特點(diǎn)無法直接觀察色素改變，且其掃描效范圍較小(5°)、成像效率較低，故限制其臨床使用[17]。目前該技術(shù)已應(yīng)用于AMD、Stargardt病、Vogt-Koyanagi-Harada病等眼底疾病的診斷[18-19]，均可呈現(xiàn)色素上皮細(xì)胞壁的微細(xì)結(jié)構(gòu)改變，但其在提示RPE細(xì)胞色素改變中的價(jià)值需進(jìn)一步探索。

3 光學(xué)相干斷層成像(Optical coherence tomography，OCT)

OCT首次出現(xiàn)于1996年，現(xiàn)已成為臨床診斷和隨訪的標(biāo)準(zhǔn)成像技術(shù)。OCT的工作原理是采用近紅外光掃描視網(wǎng)膜時(shí)，不同組織界面會(huì)產(chǎn)生不同的光反射強(qiáng)度和時(shí)間延遲，利用干涉測(cè)定儀測(cè)定近紅外光返回脈沖的延遲和強(qiáng)度變化的關(guān)系，由計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)不同反射強(qiáng)度用不同的偽彩色進(jìn)行標(biāo)記和處理，形成高分辨率活體組織的OCT橫斷面圖像。光線先輸入一個(gè)光束分離器、一個(gè)樣品臂(如視網(wǎng)膜)和一個(gè)參考臂組成的干涉儀。結(jié)果干涉圖的傅里葉變換被用來獲得作為深度函數(shù)的OCT信號(hào)。因此，處理后的OC是一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)，信號(hào)的幅度和相位都隨深度變化。單個(gè)OCT掃描(A-scan)是一個(gè)一維的測(cè)量樣品反射系數(shù)作為深度的函數(shù)。對(duì)樣品上的OCT光束進(jìn)行光柵掃描，可以得到二維和三維的圖像。在偽彩色圖像中，最前面的紅色反射為視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層(Retinal nerve fiber layer,RNFL)，以顳上和顳下最厚。此外,OCT還能分辨出視網(wǎng)膜的其他層次結(jié)構(gòu)，在RNFL的下方依次為內(nèi)外叢狀層(黃色反射)、光感受器細(xì)胞層(暗區(qū))和色素上皮與脈絡(luò)膜毛細(xì)血管層(紅色反射)。通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的進(jìn)一步處理，可以得到各層次組織厚度等相關(guān)數(shù)據(jù)[20]。OCT典型的橫向分辨率可小至1.5 μm和9 μm，取決于物像和光源的波長(zhǎng)。軸向分辨率由成像源的波長(zhǎng)和帶寬決定，在一定程度上，較小的波長(zhǎng)和較大的帶寬可以獲得更好的分辨率。眼OCT系統(tǒng)通常會(huì)集中在850-860 nm，50到100 nm帶寬,軸向分辨率3 μm和6 μm之間。利用這種組織對(duì)比機(jī)制和高軸向分辨率，可以在OCT圖像上分辨出不同的組織層，如神經(jīng)纖維層、光感受器、RPE等。OCT中 RPE層表現(xiàn)為外層視網(wǎng)膜連續(xù)、完整的反光帶，但OCT圖像的主要對(duì)比對(duì)象是背景反光，無法針對(duì)色素特異的成像，也無法評(píng)估色素的功能性改變。因此為了更好地觀察RPE細(xì)胞色素，在OCT基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)展出偏振敏感OCT和光熱OCT。

3.1 偏振敏感OCT (PS-OCT)

PS-OCT提供了樣品的雙折射信息，已被用于角膜和視網(wǎng)膜成像。要進(jìn)行PS-OCT，入射的OCT光必須循環(huán)極化。通過樣品后，樣品組成決定了發(fā)出的光可保持橢球偏振模式。單個(gè)探測(cè)器被用來測(cè)量極化光的垂直和水平分量。采用不同的算法提取樣品的偏振特性，然后將其映射到深度分辨的OCT強(qiáng)度圖像上[21]。有人利用黑色素在RPE中探測(cè)到PS-OCT信號(hào)的來源，發(fā)現(xiàn)極化均勻度與黑色素濃度相關(guān)，這一結(jié)果后來在大鼠身上得到證實(shí)[21]。然而，這種關(guān)系強(qiáng)烈依賴于樣本的顆粒分散特性，即黑色素顆粒的大小和形狀。PS-OCT已被用于從2D或3D OCT數(shù)據(jù)集中采集到AMD、RPE脫離和假卵黃樣營(yíng)養(yǎng)不良的患者的RPE形態(tài)，并可用于計(jì)算視網(wǎng)膜或脈絡(luò)膜厚度。

3.2 光熱OCT (PT-OCT)

PT-OCT是另一種功能性O(shè)CT技術(shù)。PT-OCT可檢測(cè)組織中的光學(xué)吸收物，其分辨率和成像深度與OCT類似，利用了光熱效應(yīng)，即對(duì)比劑(如黑色素)吸收的光子以熱的形式重新發(fā)射。為了進(jìn)行PT-OCT，將調(diào)幅激光器與相敏OCT系統(tǒng)相結(jié)合，該附加激光器的波長(zhǎng)與造影劑的吸收峰相對(duì)應(yīng)。光子吸收后的溫度升高會(huì)導(dǎo)致吸收器周圍的熱彈性膨脹，并改變組織的折射率。它被檢測(cè)為OCT相位信號(hào)的變化，且PT-OCT信號(hào)強(qiáng)度與組織的吸收系數(shù)成正比[22-23]。PT-OCT首先在眼睛中進(jìn)行，在色素小鼠的RPE中檢測(cè)到黑色素信號(hào)，對(duì)照組白化小鼠中沒有相應(yīng)信號(hào)[24]。后續(xù)研究是在斑馬魚中進(jìn)行的，斑馬魚每只眼睛的RPE中都有色素和非色素區(qū)域[25]，PT-OCT信號(hào)對(duì)斑馬魚眼黑色素具有特異性。PT-OCT還通過比較適應(yīng)黑暗和適應(yīng)光的野生型斑馬魚，檢測(cè)了RPE內(nèi)的黑素體遷移。

PS-OCT和PT-OCT都被認(rèn)為是功能性O(shè)CT技術(shù)。它們能產(chǎn)生像OCT這樣的高分辨率圖像，而且都能獲得視網(wǎng)膜的體積圖像，這些圖像與OCT強(qiáng)度圖像完美地重合。無論是PS-OCT還是PT-OCT儀器，都可以與OCT血管造影等其他方式相結(jié)合進(jìn)行多模態(tài)成像。

4 多光譜眼底分層成像(multi spectral fundus imaging system，MSI)

光譜學(xué)(Spectroscopy)是研究物體對(duì)光的反射特性的學(xué)科，通過測(cè)量特定光譜的反射強(qiáng)度提示物質(zhì)的特定組成(光譜指紋)，其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亦稱光譜成像(spectral imaging)，可用于分析光譜物質(zhì)的空間分布。在眼科領(lǐng)域，目前應(yīng)用技術(shù)有兩種，多光譜技術(shù)(Multispectral Imaging)和高光譜技術(shù)(Hyperspectral Imaging)。光譜技術(shù)有兩方面應(yīng)用，第一是眼底病灶的物質(zhì)組成分析，例如MSI；第二是通過不同光譜的圖像信息對(duì)比，進(jìn)行眼底血氧代謝分析。后者暫不在本文中討論。

多光譜一般采用5-10個(gè)光譜波段，波段寬度為5-10 nm，為非連續(xù)光譜；高光譜一般采用光譜較密集，可達(dá)到100個(gè)或以上掃描波普，波段寬度2-3 nm。光譜可包含可見光、紅外光，短波長(zhǎng)在眼內(nèi)組織內(nèi)穿透能力較弱，達(dá)到眼底淺層組織即發(fā)生反射和散射，主要對(duì)淺層組織進(jìn)行成像，而中波長(zhǎng)即近紅外波長(zhǎng)穿透力強(qiáng)，可達(dá)到外層視網(wǎng)膜、RPE和脈絡(luò)膜層。MSI是使用不同的光波長(zhǎng)度的發(fā)光二極管(LED)改進(jìn)技術(shù)，范圍從550納米(綠色)到850納米(紅外線)，以檢查視網(wǎng)膜層和脈絡(luò)膜。機(jī)器中的圖像形成取決于入射光的波長(zhǎng)和反射光的波長(zhǎng)。因?yàn)樵谝暰W(wǎng)膜的不同層和不同組織在相同層中的顏色不同，MSI可以顯示從視網(wǎng)膜到脈絡(luò)膜清晰的視野。MSI在臨床上多用于糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)、息肉樣脈絡(luò)膜血管病、視網(wǎng)膜靜脈阻塞等疾病的檢查診斷[26]。MSI在PRE色素病變中的應(yīng)用包括：AMD相關(guān)色素上皮改變的形態(tài)學(xué)觀察[27]、nv-AMD中RPE的觀察、VKH色素改變、脈絡(luò)膜腫瘤對(duì)色素上皮變化的觀察等[28]。其主要弊端為基于LED系統(tǒng)的光譜照相系統(tǒng)容易受到晶狀體散射的影響，影響圖像質(zhì)量。由于目前MSI圖像無法精準(zhǔn)分層，需要結(jié)合SLO或OCT成像系統(tǒng)對(duì)成像平面精準(zhǔn)定位。

5 總結(jié)

近年來，隨著電子設(shè)備和成像技術(shù)的完善和創(chuàng)新，視網(wǎng)膜色素眼底成像，從傳統(tǒng)的彩色眼底照相發(fā)展到現(xiàn)如今的光學(xué)相干斷層成像、多光譜成像等先進(jìn)成像技術(shù)，為廣大眼底疾病發(fā)展進(jìn)程中的各種形態(tài)學(xué)特征改變提供了極大的幫助，不過現(xiàn)有的成像技術(shù)也依然存在各種各樣的短板和局限性。

彩色眼底照相可進(jìn)行初步色素的定性分析，眼底反射測(cè)定法雖然可以定量檢測(cè)RPE細(xì)胞中的黑色素，但分析模型復(fù)雜，因此難以在實(shí)踐中實(shí)施；NIR-AF易于臨床解讀，但很難將脈絡(luò)膜黑色素和RPE細(xì)胞黑色素分離；AO可呈現(xiàn)色素上皮層的六角形結(jié)構(gòu)，能直接觀察色素上皮細(xì)胞的形態(tài)，但無法直接觀察色素改變，且其掃描效范圍較小(5°)、成像效率較低；OCT能分辨出不同的組織層，如神經(jīng)纖維層、光感受器、RPE等，但無法針對(duì)色素特異成像，也無法評(píng)估色素的功能性改變；多光譜眼底成像和高光譜眼底成像可利用窄光譜成像技術(shù)，對(duì)視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜進(jìn)行多層成像，也可單獨(dú)提取色素上皮信息相對(duì)豐富的層次，但尚未實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)分層。

不同眼底成像系統(tǒng)從不同角度呈現(xiàn)RPE細(xì)胞中的黑色素分布和形態(tài)變化，為臨床提供多種診斷信息，有利于疾病的綜合分析和判斷。