卻志群　沈春修　王舸泓　李麗娜

摘要：為了培養(yǎng)學生的科研興趣和創(chuàng)新能力，使學生了解學科前沿，掌握新技術(shù)和新方法，縮小理論與實踐距離，結(jié)合教師科研部分成果設(shè)計了金色穎殼水稻種質(zhì)資源創(chuàng)制研究綜合型拓展實驗，包括選題的背景、實驗內(nèi)容、實驗結(jié)果、教學實施及教學效果等。實踐結(jié)果表明，選題結(jié)合實際，學生參與感強，在完成綜合型實驗過程中，學生文獻查閱能力、動手實操能力、科研興趣和創(chuàng)新能力都得到了很大提高。這種新的教學模式適合在我校更大學生群體中推薦與推廣。

關(guān)鍵詞：綜合拓展實驗;創(chuàng)新能力;遺傳轉(zhuǎn)化

高效的人才培養(yǎng)主要是通過教學和科研活動來實現(xiàn)的。教師在長期的科研活動中所取得的成果，轉(zhuǎn)化為教學資源，是對實驗教學內(nèi)容的補充，也是實驗教學模式的更新。通過這種模式縮小了理論與實踐距離，促進了學生實踐能力和創(chuàng)新能力的提高，也促進了實驗教學的改革。農(nóng)學專業(yè)是我校傳統(tǒng)優(yōu)勢專業(yè)，在學科建設(shè)、基地建設(shè)、實驗室建設(shè)等方面都取得了很大成績，為了更好地利用這些資源，彌補實驗教學中出現(xiàn)的實驗項目獨立、前后項目無關(guān)聯(lián)、綜合型項目偏少，理論與實踐聯(lián)系不緊密、學生動手實操能力不足等問題，結(jié)合教師的科研成果，設(shè)計了一個覆蓋本專業(yè)育種學、基因工程、分子生物學、植物組織培養(yǎng)等多門主干課程知識點的綜合型拓展實驗項目：金色穎殼水稻種質(zhì)資源創(chuàng)制研究，該實驗選題結(jié)合實際，學生參與感強，在完成綜合型實驗過程中，學生文獻查閱能力、動手實操能力、科研興趣和創(chuàng)新能力都得到了很大提高。

1選題背景

CRISPR/Cas9（clustered regulatory interspersed short palindromic repeat）基因組編輯技術(shù)是近年來發(fā)展的一種新型靶向基因敲除技術(shù)，由于其突變效率高、制作簡單及成本低的特點，被認為是一種具有廣闊應用前景的基因組定點改造分子工具，將對生物學的基礎(chǔ)研究與應用產(chǎn)生深遠的影響。本項目在課題組前期研究基礎(chǔ)上擬采用農(nóng)桿菌介導法，將攜帶了靶標位點的CRISPR/Cas9植物基因編輯表達載體pSK51-Cas9-OsCHI轉(zhuǎn)入水稻受體材料TP309，獲得部分植株并對其進行潮霉素篩選標記基因陽性鑒定，最終通過表型鑒定篩選獲得金色穎殼的突變植株，為后續(xù)深入研究打下堅實基礎(chǔ)。

2實驗內(nèi)容

選用水稻TP309成熟種子，采用農(nóng)桿菌介導法，通過水稻愈傷組織誘導、愈傷組織的農(nóng)桿菌浸染及共培養(yǎng)、抗性愈傷組織的篩選、抗性愈傷組織的潮霉素基因特異引物檢測、T代植株再生等幾個步驟完成實驗。實驗設(shè)計思路完整，各實驗項目之間聯(lián)系緊密，內(nèi)容涉及多學科知識點。

3實驗結(jié)果

3.1農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化

對pSK51-Cas9-OsCHI農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子進行活化、懸浮后，使用適當濃度的農(nóng)桿菌菌液侵染受體水稻品種TP309的胚性愈傷組織;經(jīng)過共培養(yǎng)后，將愈傷組織接入到篩選培養(yǎng)基（含50mg/L潮霉素）上;經(jīng)過2次篩選后，愈傷組織的生長得到明顯的抑制。挑選增殖明顯的、生長良好的陽性抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，經(jīng)分化培養(yǎng)和生根培養(yǎng)等實驗過程后，攜帶了靶標位點的CRISPR/Cas9植物基因編輯表達載體pSK51-Cas9-OsCHI獲得了轉(zhuǎn)化苗（圖1）。

3.2抗性愈傷組織的潮霉素基因特異引物檢測

取篩選培養(yǎng)基上的抗性愈傷組織用鑷子夾碎成兩半，一半接種到分化培養(yǎng)基上，另一半于55℃干燥箱中烘2h后提取DNA，然后進行潮霉素基因特異引物分子檢測，結(jié)果表明，大部分的抗性愈傷組織都呈現(xiàn)潮霉素陽性（圖2）。

M：DNA ladder;l：清水對照;2：野生型陰牲對照;

3-13：陽性抗性愈傷組織

圖2抗性愈傷組織潮霉素引物PCR陽性鑒定

3.3植株的表型觀察

將經(jīng)過煉苗的植株移栽一段時間后，突變體在抽穗期，呈現(xiàn)出明顯不同于野生品種的金色穎殼（圖3）。進一步觀察發(fā)現(xiàn)，除了稻穎變成金色，種子形狀和其他性狀均沒有發(fā)現(xiàn)異常。這些結(jié)果表明，本綜合拓展實驗成功獲得了通過定向編輯水稻OsCHI基因的金色水稻種質(zhì)資源。

4教學實施

農(nóng)學專業(yè)學生經(jīng)過兩年的學習，已經(jīng)完成了生物化學、基因工程、植物組織培養(yǎng)、分子生物學、遺傳學、育種學相關(guān)課程的理論知識和實驗技能的學習，因此，該綜合性實驗安排在大三上學期，4～16周的課余時間。此次綜合拓展實驗項目是首次開設(shè)，充分尊重學生的意愿和興趣，在大二下學期課程結(jié)束前兩周，指導教師把實驗項目的內(nèi)容、目的、要求及大致實驗方案等以PPT的形式通過QQ和微信等網(wǎng)絡(luò)平臺發(fā)放給學生，學生自愿報名參加。大部分學生持觀望態(tài)度、少部分學生不感興趣，最終報名學生8人。為了便于后期研討與管理，將8名學生分成兩組，每組4人（1名組長，3名成員）。實驗前2周，教師召集所有學生布置實驗前的準備工作，并給學生發(fā)放實驗項目相關(guān)資料，要求每組學生根據(jù)資料信息整理出詳細實驗步驟及注意事項，然后發(fā)回給指導老師修改完善。方案定好后，開始正式實施。正式實施階段每隔一個禮拜，組長要給教師匯報本周實驗進展，共同探討前期實驗效果及后續(xù)實驗安排。實驗全部結(jié)束后，每個學生要提交一份完整的實驗報告和一份實驗心得體會。

5教學效果

在本次拓展項目中，學生作為主體參與了實驗方案的設(shè)計、實驗過程及實驗結(jié)果的分析，最終取得如下實踐成果：（1）熟練掌握了水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系及鑒定工作，學會了規(guī)范化操作流程，提高了動手實踐能力。（2）精通文獻檢索和查閱技能，為畢業(yè)論文和項目申報書的書寫及參與科研工作提供了便利。其中5個學生加入指導教師科研團隊，從事簡單科研工作，并發(fā)表核心期刊論文2篇。（3）通過完成拓展項目，開闊了學生視野，豐富了學生課余生活，也為申報各類競賽項目做了鋪墊。8個學生以團隊的形式在不到2年時間里，成功申請了2項大學生創(chuàng)新實踐項目。（4）學生積極了解本專業(yè)最新科研動態(tài)，增強了學生的科研探索意識，培養(yǎng)了科研興趣。參與的8名學生有7名同學分別考取了中山大學、華中農(nóng)業(yè)大學、南京農(nóng)業(yè)大學、華南農(nóng)業(yè)大學、長江大學的研究生。

6小結(jié)

綜合型拓展實驗項目選題來自教師科研部分成果，是科研反哺教學的體現(xiàn)。該實驗設(shè)計到的操作技術(shù)融合了分子生物學、基因工程、植物組織培養(yǎng)等多門學科的基礎(chǔ)實驗，把獨立實驗項目連接成一個整體，有利于學生形成良好的知識架構(gòu)。通過實驗學生收獲了水稻穎殼顏色突變的植株，為該技術(shù)在水稻育種生產(chǎn)上的進一步應用提供了技術(shù)支撐?？s小了理論向?qū)嵺`轉(zhuǎn)化的距離，體現(xiàn)了知識的應用價值。總之，這種新的教學模式在小范圍學生中的實施已取得較好效果，在后續(xù)的教學過程中，為了覆蓋更多的學生群體，將從項目選題多樣化和引入不同的教師科研團隊進行推廣和實施兩個方面進一步優(yōu)化，為最終培養(yǎng)適應社會需求、綜合能力強的高質(zhì)量本科人才提供參考。

*通訊作者：沈春修（1979— ），男，漢族，湖南溆浦人，副教授，研究方向：作物遺傳育種教學與科研。