裴華麗　劉永光　喬寧　李美芹　薛其勤　楊天慧

摘要：克隆番茄黃化曲葉病毒的復(fù)制酶基因（TYLCV-Rep），并構(gòu)建其植物表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入番茄子葉外植體。經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)、潮霉素篩選和分化再生，獲得21株潮霉素抗性植株。PCR檢測(cè)和Southern Blot檢測(cè)結(jié)果表明，有3株呈陽(yáng)性檢測(cè)反應(yīng)，說(shuō)明TYLCV-Rep基因已整合到番茄基因組中，陽(yáng)性率為14.3%。煙粉虱接種試驗(yàn)結(jié)果表明，番茄轉(zhuǎn)基因植株較非轉(zhuǎn)基因植株對(duì)番茄黃化曲葉病毒的抗性明顯增強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：復(fù)制酶基因；黃化曲葉病毒；番茄；遺傳轉(zhuǎn)化；表達(dá)載體

中圖分類(lèi)號(hào)：S436.412.1+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）02-0041-04

收稿日期：2014-03-19

基金項(xiàng)目：國(guó)家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)（編號(hào)：CARS-25）；山東省高等學(xué)校科技計(jì)劃 （編號(hào)：J07WG06、J09LC59、J10LC73、J12LE56）；濰坊科技學(xué)院校級(jí)課題（編號(hào)：W13K029、W13K033、W13K051）；山東半島藍(lán)色工程研究院科研計(jì)劃（編號(hào)：sdlgy2013y014）。

作者簡(jiǎn)介：裴華麗（1978—），女，山東濰坊人，碩士，講師，主要從事蔬菜分子育種研究。E-mail：peihuali2@163.com。

通信作者：劉永光，碩士，講師，主要從事植物病理方面的研究。E-mail：ygliu425@163.com。番茄在中國(guó)各蔬菜產(chǎn)區(qū)均有大面積的種植，在我國(guó)蔬菜周年供應(yīng)中占有非常重要的地位。隨著溫室大棚的推廣及蔬菜反季節(jié)栽培效益的提高，溫室番茄栽培面積連年增長(zhǎng)，其病害的發(fā)生也呈現(xiàn)逐步加重的趨勢(shì)。近年來(lái)，在番茄主產(chǎn)區(qū)相繼發(fā)現(xiàn)的番茄黃化曲葉病毒，對(duì)番茄植株的生長(zhǎng)、開(kāi)花、坐果等方面均產(chǎn)生嚴(yán)重的危害，給當(dāng)?shù)氐姆焉a(chǎn)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-6]。番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）屬雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）[4-7]，是一類(lèi)世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生的單鏈環(huán)狀DNA病毒。自1986年首次將煙草花葉病毒（ TMV） 外殼蛋白（ coat protein，CP） 基因?qū)霟煵菖嘤隹筎MV植株以來(lái)，利用病毒本身的基因?qū)胫参铽@得抗病毒植株已成為抗病毒基因工程的重要手段。在番茄轉(zhuǎn)基因抗病毒育種中，主要利用病毒的外殼蛋白基因和復(fù)制相關(guān)蛋白（replication-associated protein，Rep）基因。

復(fù)制酶是指由病毒編碼的，能特異合成病毒正負(fù)鏈RNA的RNA聚合酶，其核心功能是合成全長(zhǎng)的病毒基因組RNA。在病毒編碼的復(fù)制酶組分中存在多個(gè)保守序列，這些序列對(duì)聚合酶的活性必不可少[8]。自1990年Golemboski等將TMV U1株編碼的復(fù)制酶的一部分基因序列轉(zhuǎn)入煙草中，得到了高抗的煙草植株[9]以來(lái)，人們已對(duì)許多病毒的復(fù)制酶基因介導(dǎo)的抗病性及其抗性機(jī)制開(kāi)展了深入研究[10-13]。但利用轉(zhuǎn)番茄黃化曲葉病毒的復(fù)制酶基因來(lái)獲得番茄抗黃化曲葉病毒的實(shí)例還未見(jiàn)報(bào)道。本研究從番茄黃化曲葉病毒株中克隆黃化曲葉病毒的復(fù)制酶基因，并將其轉(zhuǎn)入番茄中以期獲得抗番茄黃化曲葉病毒植株，從根本上解決當(dāng)前番茄普遍存在的病害問(wèn)題，盡快培育出適合山東乃至國(guó)內(nèi)主要番茄種植區(qū)的抗番茄黃化曲葉病毒株系，以滿足目前番茄產(chǎn)業(yè)的需求。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1植物材料植物受體番茄品種菜都六號(hào)購(gòu)于山東省壽光市金田種苗有限公司。TYLCV病毒樣品采自山東省壽光市，番茄植株上部卷曲黃化及矮縮等具有感染番茄黃花曲葉病毒典型癥狀的葉片。

1.1.2菌株與試劑限制性內(nèi)切酶BglⅡ、Eco 911、T4-DNA連接酶、DNA Marker均購(gòu)自MBI公司，Taq DNA聚合酶、堿性磷酸酶購(gòu)自寶生物工程有限公司，植物基因組DNA提取試劑盒、凝膠快速純化試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒等均購(gòu)自北京全式金公司。植物表達(dá)載體pCAMBIA1304、農(nóng)桿菌LBA4404由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)竺曉平老師惠贈(zèng)。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、BL21由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。瓊脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物、氨芐青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）、頭孢霉素（Cef）、潮霉素（Hyg）、乙酰丁香酮（AS）、利福平（Rif）、鏈霉素（Str）、6-芐氨基嘌呤（6-BA）、3-吲哚乙酸（IAA）均購(gòu)自Sigma公司，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。引物均由北京華大基因科技有限公司合成，其序列如表1所示。

1.1.3培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，各培養(yǎng)基附加蔗糖30 g/L、瓊脂7.5 g/L，pH值調(diào)至5.8。種子發(fā)芽的培養(yǎng)基為1/2MS；預(yù)培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L；共培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 005 mg/L；選擇培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+Hyg 10 mg/L+Cb 400 mg/L；生根培基為1/2MS+NAA 0.05 mg/L+Hyg 10 mg/L+ Cb 200 mg/L。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1TYLCV-Rep基因的克隆用植物基因組DNA提取表1供試引物的序列情況

試劑盒提取番茄病葉總DNA，根據(jù)GenBank中雙生病毒序列設(shè)計(jì)引物Rep-F和Rep-R，以提取的番茄病葉總DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：2×Taq MasterMix 125 μL，Rep-F（10 pmol/L）1.0 μL，Rep-R（10 pmol/L）1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，加ddH2O至終體積25.0 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃變性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2TYLCV-Rep基因片段的回收及克隆載體的連接、轉(zhuǎn)化用凝膠快速純化試劑盒對(duì)符合預(yù)期大小的片段進(jìn)行回收、純化。采用凍融法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，將菌液涂布于LB+Tet 100 mg/L+Amp 50 mg/L的平板上，室溫放置1 h，待菌液完全被吸收后，倒置平板放于 37 ℃ 培養(yǎng)過(guò)夜。

1.2.3轉(zhuǎn)化子的鑒定從轉(zhuǎn)化平板上挑取白色菌斑，用含有50 mg/L氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基于37 ℃振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，用引物Rep-F、Rep-R 進(jìn)行PCR檢測(cè)，限制性內(nèi)切酶BglⅡ和SpeⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆的正確性，將含有的重組質(zhì)粒陽(yáng)性克隆命名為pT-Rep-1，并送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.2.4植物表達(dá)載體的構(gòu)建按照?qǐng)D1所示基因圖譜構(gòu)建植物表達(dá)載體。用BglⅡ和SpeⅠ將TYLCV-Rep基因從克隆載體pT-Rep-1上切下，然后與同樣雙酶切的植物表達(dá)載體pCAMBIA1304連接后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，在含有50 mg/L Kan抗性的平板上進(jìn)行培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR及BglⅡ、SpeⅠ雙酶切鑒定。將連接正確的重組質(zhì)粒命名為1304-Rep，并送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.2.5番茄外植體材料的獲得選取飽滿、大小一致、新鮮的番茄種子用清水反復(fù)沖洗數(shù)次，先后用75%乙醇對(duì)番茄種子消毒30 s、20%次氯酸鈉消毒10 min，無(wú)菌水沖洗4～5遍，無(wú)菌濾紙吸干后，接種于種子發(fā)芽培養(yǎng)基中。暗培養(yǎng)至大多數(shù)種子發(fā)芽露白后，將其放到光照16 h/d、光照強(qiáng)度 1 600～1 800 lx、溫度（24±2） ℃的條件下培養(yǎng)1周后，取番茄無(wú)菌苗的子葉，切去葉尖、葉柄，其余部分切成0.5 cm×05 cm大小的葉塊，子葉正面向上接種至誘導(dǎo)愈傷的培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。

1.2.6農(nóng)桿菌介導(dǎo)Rep基因轉(zhuǎn)化番茄采用凍融法將重組質(zhì)粒1304-Rep轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌（LBA4404）中，于YEB+Rif 30 mg/L+Str 30 mg/L+Kan 50 mg/L平板上28 ℃培養(yǎng) 48 h。挑取含有重組質(zhì)粒1304-Rep轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌（LBA4404）單菌落，接種到加Str和Kan的10 mL液體YEB中，28 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，以1 ∶40加入到新鮮的無(wú)任何抗生素的YEB培養(yǎng)基中，于28 ℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)3～4 h，取液體MS培養(yǎng)基稀釋20倍后用于侵染。收集預(yù)培養(yǎng)基上的子葉放在培養(yǎng)皿中，倒入稀釋好的菌液，輕輕搖勻使外植體和菌液充分接觸，侵染10 min后，取出子葉，置于無(wú)菌濾紙上吸去多余菌液，接種到共培養(yǎng)基上28 ℃暗培養(yǎng)3 d。經(jīng)共培養(yǎng)的外植體，轉(zhuǎn)入抑菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)接于篩選培養(yǎng)基中，每2周更換新鮮培養(yǎng)基，并逐漸降低Carb濃度至200 mg/L。經(jīng)篩選再生的抗性芽長(zhǎng)至1.5～2 cm時(shí)，將其切下并剔凈基部附著的愈傷組織，接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，待幼苗生長(zhǎng)至3～4張真葉時(shí)，進(jìn)行煉苗，移栽至營(yíng)養(yǎng)缽中。

1.2.7潮霉素篩選濃度試驗(yàn)在篩選培養(yǎng)基中分別添加0、2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20 mg/L Hyg，每個(gè)濃度篩選培養(yǎng)基接種10～15個(gè)外植體；在（25±2） ℃、光照約16 h/d、光照強(qiáng)度3 000 lx條件下培養(yǎng)，20 d后觀察生長(zhǎng)情況。

統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率和不定芽分化率。

1.2.8番茄抗性植株的檢測(cè)

1.2.8.1抗性植株的PCR檢測(cè)再生番茄植株的基因組DNA采用SDS法微量提取[14]。以質(zhì)粒1304-Rep作陽(yáng)性對(duì)照，以未轉(zhuǎn)基因的番茄基因組DNA為陰性對(duì)照，利用引物Rep-1304-F和Rep-1304-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件同“1.2.3”節(jié)，PCR產(chǎn)物經(jīng)10 mg/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.8.2抗性植株的Southern Blot檢測(cè)對(duì)以上擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行Southern Blot檢測(cè)，用生物素地高辛標(biāo)記的Rep基因雜交探針、Southern轉(zhuǎn)膜、預(yù)雜交、雜交、洗膜、檢測(cè)等方法均按Roche 公司“DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I”中的說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.8.3轉(zhuǎn)基因番茄T1代植株的PCR檢測(cè)待轉(zhuǎn)基因番茄T1代植株長(zhǎng)至2葉1心時(shí)，采取尚未脫落的子葉提取基因組DNA。利用TYLCV-Rep基因上對(duì)應(yīng)的特異引物進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件同“1.2.3”節(jié)，PCR產(chǎn)物經(jīng) 10 mg/mL 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.8.4轉(zhuǎn)基因番茄T1代植株的抗病性鑒定2013年3月在濰坊科技學(xué)院蔬菜育種基地將轉(zhuǎn)基因T1番茄種子及同品種的非轉(zhuǎn)基因番茄種子播種于托盤(pán)中，當(dāng)待測(cè)番茄植株長(zhǎng)到3～4張真葉時(shí)，分別移栽于溫室大棚及繁殖保存煙粉虱的防蟲(chóng)溫室，每個(gè)番茄材料設(shè)計(jì)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10株，植株隨機(jī)排列，常規(guī)管理，分別于移栽后7、14、21、42 d觀察葉片感病情況。

對(duì)病情調(diào)查及抗性評(píng)價(jià)時(shí)，由病級(jí)計(jì)算病情指數(shù)（DI）。根據(jù)Hanson等的分級(jí)方法[15-16]進(jìn)行病級(jí)分級(jí)。本研究以42 d 時(shí)調(diào)查的病情指數(shù)為鑒定依據(jù)。

病情指數(shù)（DI）=[（各級(jí)發(fā)病株數(shù)×病級(jí)數(shù)）/（最高發(fā)病級(jí)數(shù)×調(diào)查株數(shù)）]×100。

按病情指數(shù)（DI）分別劃分為免疫，不侵染，DI=0；高抗（HR），0

2結(jié)果與分析

2.1TYLCV-Rep基因的PCR擴(kuò)增

以F-Rep和R-Rep為引物，番茄病葉總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約1 200 bp的特異性擴(kuò)增帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖2）。以經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè)的重組質(zhì)粒為模板，用Rep-1304-F和Rep-1304-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均得到約 1 100 bp 的片段。

2.2基因序列測(cè)定及分析

將所得DNA序列輸入GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行Blast檢索，選擇并下載相應(yīng)序列，采用DNASTAR、DNAMAN和MEGA 3.1軟件對(duì)所得到的核苷酸序列與GenBank中收錄的相應(yīng)基因的核苷酸序列進(jìn)行比較和分析。結(jié)果證明，番茄黃化曲葉病毒復(fù)制酶基因核苷酸序列 1 074 bp，編碼357個(gè)氨基酸，與GenBank中相應(yīng)的復(fù)制酶基因序列一致。

2.3植物表達(dá)載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化

將構(gòu)建好的1304-Rep轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌，提取重組質(zhì)粒DNA，并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到約1 100 bp特異性擴(kuò)增帶（圖3），片段大小與預(yù)期結(jié)果一致；經(jīng)SpeⅠ和BglⅡ進(jìn)行雙酶切均得到1條約1 100 bp的條帶（圖4），測(cè)序結(jié)果表明，1 074 bp的不含終止密碼的TYLCV的Rep基因序列已正向插入pCAMBIA1304載體中，沒(méi)有發(fā)生移碼，堿基沒(méi)有改變，與GenBank中報(bào)道的序列完全一致。

2.4潮霉素濃度篩選試驗(yàn)

如圖5所示，番茄子葉對(duì)潮霉素較敏感，當(dāng)潮霉素濃度為10 mg/L時(shí)，盡管仍然存在子葉增厚的現(xiàn)象，但愈傷組織誘導(dǎo)率急劇下降。當(dāng)潮霉素濃度為12.5 mg/L時(shí)，只有少數(shù)子葉加厚，極少誘導(dǎo)出愈傷組織。當(dāng)潮霉素篩選濃度達(dá)到 15 mg/L 時(shí)，無(wú)外植體愈傷組織長(zhǎng)出，也無(wú)外植體膨大、加厚，外植體在4～6 d內(nèi)相繼黃化死亡。為了抑制殺死非轉(zhuǎn)化細(xì)胞，同時(shí)又保證轉(zhuǎn)化細(xì)胞能正常生長(zhǎng)，所以選擇潮霉素濃度為12.5 mg/L作為番茄轉(zhuǎn)基因材料的篩選濃度。

2.5番茄抗性植株的檢測(cè)

2.5.1番茄抗性植株的PCR檢測(cè)將潮霉素篩選呈陽(yáng)性的21株番茄植株組培苗移栽到營(yíng)養(yǎng)缽中，提取21株（TYLCV-Rep）潮霉素抗性番茄植株葉片及陰性對(duì)照的DNA，以相應(yīng)質(zhì)粒DNA為陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用10 mg/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖6）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，21株抗性植株中，有3株能擴(kuò)增出與質(zhì)粒DNA大小一致的1 200 bp左右的條帶，而陰性對(duì)照和另外18株均未擴(kuò)增出任何條帶，說(shuō)明TYLCV-Rep基因已整合到番茄基因組中，陽(yáng)性率為14.3%。

2.5.2轉(zhuǎn)基因番茄植株的Southern Blot 檢測(cè)選取PCR反應(yīng)呈陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因番茄植株和非轉(zhuǎn)基因番茄植株葉片的總DNA，以非轉(zhuǎn)基因番茄植株葉片總DNA為陰性對(duì)照，以質(zhì)粒酶切產(chǎn)物為陽(yáng)性對(duì)照，分別經(jīng)SpeⅠ和BglⅡ進(jìn)行雙酶切后的酶切產(chǎn)物進(jìn)行Southern Blot雜交。結(jié)果表明，質(zhì)粒及轉(zhuǎn)基因番茄植株出現(xiàn)了相應(yīng)的雜交信號(hào)，而未轉(zhuǎn)基因番茄植株則沒(méi)有相應(yīng)的雜交信號(hào)（圖7）。說(shuō)明TYLCV-Rep基因都已經(jīng)整合進(jìn)番茄的基因組中。

2.5.3轉(zhuǎn)基因番茄T1代的PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因番茄T1代植株長(zhǎng)至2葉1心時(shí)，采取尚未脫落的子葉提取基因組DNA。利用TYLCV-Rep基因上對(duì)應(yīng)的特異引物進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分約為1 200 bp，部分樣品的電泳結(jié)果見(jiàn)圖8。轉(zhuǎn)基因番茄T1代植株分別檢測(cè)到45個(gè)陽(yáng)性植株，顯示TYLCV-Rep基因可以在后代中穩(wěn)定遺傳。

2.5.4轉(zhuǎn)基因番茄T1代的抗病性鑒定利用煙粉虱對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)行侵染試驗(yàn)。用PCR反應(yīng)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)TYLCV-Rep基因的番茄抗性植株做侵染試驗(yàn)，以非轉(zhuǎn)基因植株作對(duì)照，防蟲(chóng)溫室中植株表現(xiàn)如表2所示，非轉(zhuǎn)基因植株對(duì)TYLCV表現(xiàn)高感（HS），而轉(zhuǎn)基因植株對(duì)TYLCV表現(xiàn)出抗性（R）。田間抗病性觀察發(fā)現(xiàn)，侵染7 d后轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因植株葉片均未發(fā)現(xiàn)有異常變化；14 d后發(fā)現(xiàn)非轉(zhuǎn)基因番茄植株葉片出現(xiàn)輕微黃化，轉(zhuǎn)基因植株葉片未發(fā)現(xiàn)有異常變化；21 d后非轉(zhuǎn)基因番茄植株葉片表現(xiàn)出典型的黃化卷曲癥狀，轉(zhuǎn)基因植株葉片未發(fā)現(xiàn)有異常變化；42 d后非轉(zhuǎn)基因番茄植株葉片表現(xiàn)出典型的嚴(yán)重黃化卷曲癥狀，轉(zhuǎn)基因植株葉片未發(fā)現(xiàn)有異常變化（圖9）。表明轉(zhuǎn)基因番茄植株的抗病性較非轉(zhuǎn)基因植株明顯增強(qiáng)。

表2番茄黃化曲葉病毒病抗性鑒定結(jié)果

品種侵染接種鑒定病情指數(shù)抗級(jí)田間鑒定抗級(jí)轉(zhuǎn)基因番茄6.8RR非轉(zhuǎn)基因番茄52.3HSHS

3結(jié)論與討論

與傳統(tǒng)育種方式相比，通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段獲得抗性更具優(yōu)越性，轉(zhuǎn)基因操作將有效單基因轉(zhuǎn)入優(yōu)良的栽培品種中，避免了常規(guī)雜交育種中，受多基因控制及數(shù)量性狀遺傳等復(fù)雜性，從而使植株有效獲得相應(yīng)的抗性。本研究TYLCV-Rep的全長(zhǎng)序列通過(guò)構(gòu)建相應(yīng)的植物表達(dá)載體將其轉(zhuǎn)入番茄中，獲得了抗病性明顯增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因株系，該結(jié)果與Carr等的研究結(jié)果[17-18]一致。

在植物對(duì)病毒產(chǎn)生抗性的過(guò)程中可能涉及到一系列基因的表達(dá)，有些膜上基因的優(yōu)先表達(dá)在植物的防御機(jī)制中起非常重要的作用。Carr等認(rèn)為，轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的復(fù)制酶在病毒的侵染過(guò)程中作為一種調(diào)節(jié)蛋白發(fā)揮功能，打破了病毒正鏈和負(fù)鏈復(fù)制的平衡[19]；而B(niǎo)aulcombe則認(rèn)為，復(fù)制酶基因是在RNA水平上介導(dǎo)對(duì)病毒的抗性[20]。利用這些與抗性表達(dá)有關(guān)的關(guān)鍵基因通過(guò)生物工程手段來(lái)提高番茄抗性的調(diào)控機(jī)理，仍需進(jìn)一步研究；另外，對(duì)獲得相應(yīng)抗性的番茄在某些條件下（如高溫）會(huì)部分喪失抗性的原因，也將是番茄抗病育種的研究?jī)?nèi)容之一。

本研究成功克隆了番茄黃化曲葉病毒的復(fù)制酶基因，通過(guò)基因工程手段，將抗病基因?qū)敕鸦蚪M，獲得了抗病性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因番茄植株，通過(guò)PCR、Southern-blot檢測(cè)表明該復(fù)制酶基因已成功轉(zhuǎn)入番茄基因組中，煙粉虱侵染的抗性鑒定結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因番茄對(duì)TYLCV的抗性明顯增強(qiáng)。本研究為培育番茄抗黃化曲葉病毒的抗病品種提供了可靠的理論依據(jù)和相應(yīng)的技術(shù)保障。

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