周文波等

摘要：以過(guò)表達(dá)IrrE基因油菜T3代植株和非轉(zhuǎn)基因油菜植株為試驗(yàn)材料，研究不同濃度NaCl脅迫下過(guò)表達(dá)IrrE對(duì)油菜植株抗鹽脅迫能力的影響，檢測(cè)不同濃度NaCl脅迫下非轉(zhuǎn)基因和過(guò)表達(dá)IrrE基因油菜植株葉片中的抗氧化酶活性如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）的活性以及丙二醛（malondialdehyde，MDA）、脯氨酸、可溶性糖含量和相對(duì)電導(dǎo)率（REC）。結(jié)果顯示，隨著NaCl濃度的增加，非轉(zhuǎn)基因和過(guò)表達(dá)IrrE基因油菜植株各自的抗氧化酶活性均呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，而MDA含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量和相對(duì)電導(dǎo)率都隨著NaCl濃度的增加而逐漸增加；但與非轉(zhuǎn)基因相比，在高濃度NaCl脅迫下過(guò)表達(dá)IrrE基因油菜植株具有較高的抗氧化酶活性、脯氨酸含量和可溶性糖含量以及較低的MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率，表明在高鹽脅迫下過(guò)表達(dá)IrrE能夠顯著地提高轉(zhuǎn)基因油菜植株的抗鹽脅迫能力。

關(guān)鍵詞：IrrE基因；油菜；鹽脅迫；氧化酶

中圖分類(lèi)號(hào)： Q945.78文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）02-0104-04

收稿日期：2014-08-31

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（編號(hào)：2013CB733903）；國(guó)家“863”計(jì)劃（編號(hào)：2012AA063503）；國(guó)家轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ?xiàng)（編號(hào)：2014ZX0801201B）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（編號(hào)：201103007）；西南科技大學(xué)博士研究基金（編號(hào)：11zx7104）；四川省生物質(zhì)資源利用與改性工程技術(shù)研究中心開(kāi)放基金（編號(hào)：13zxsk04）。

作者簡(jiǎn)介：周文波（1987—），男，四川自貢人，碩士研究生，從事植物遺傳轉(zhuǎn)化與抗逆分析研究。E-mail：zhouwenboxkd@sina.com。

通信作者：王勁，教授，從事植物遺傳方向的研究。E-mail：wjdsz@vip.sina.com。近年來(lái)，由于人們?cè)谵r(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中的不科學(xué)灌溉、濫用化肥、濫伐森林導(dǎo)致的植被破壞以及工業(yè)活動(dòng)產(chǎn)生的溫室氣體等因素，使土壤鹽堿化問(wèn)題日益嚴(yán)重，土壤鹽堿化已成為制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的重要因子之一[1-2]。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，全球鹽堿土總面積約為10億hm2，約占陸地面積的10%；世界上許多國(guó)家和地區(qū)的土壤均存在鹽堿化的風(fēng)險(xiǎn)，中國(guó)受鹽堿化影響的土地面積占可利用土地總面積的4.88%[3]。因此，對(duì)鹽堿地的改造治理、合理開(kāi)發(fā)、高效利用勢(shì)在必行。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的飛速發(fā)展，利用分子育種技術(shù)尤其是轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗鹽脅迫作物新品種已成為當(dāng)前抗逆研究的熱門(mén)領(lǐng)域，也成為高效利用開(kāi)發(fā)鹽堿土的重要手段之一。因此，了解植物抗鹽脅迫的分子調(diào)控機(jī)理與抗鹽脅迫基因的充分挖掘和研究對(duì)培育抗鹽脅迫作物新品種具有重要意義。

土壤含鹽量過(guò)高嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，過(guò)量鹽離子主要通過(guò)引發(fā)滲透脅迫、離子毒害和氧化脅迫對(duì)植物造成傷害，植物則通過(guò)調(diào)節(jié)氣孔開(kāi)度、合成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、區(qū)隔過(guò)量離子以及清除活性氧物質(zhì)等方式來(lái)減輕脅迫損傷[4]。IrrE基因定位于耐輻射異常球菌（Deinococcus radiodurans）的基因組1號(hào)染色體上，編號(hào)DR_0167，全長(zhǎng)987 bp，其在耐輻射異常球菌對(duì)電離輻射引起的DNA損傷修復(fù)過(guò)程中具有重要作用。IrrE基因作為一種輻射應(yīng)答的調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)節(jié)異常球菌 R1中recA和pprA基因的表達(dá)，他們分別編碼重組酶A和輻射誘導(dǎo)蛋白[5]。Gao等研究發(fā)現(xiàn)，將IrrE基因在大腸桿菌中異源表達(dá)能夠提高菌株的輻射抗性以及氧自由基的清除能力[6]。Pan等對(duì)轉(zhuǎn)IrrE基因菌株及對(duì)照菌株進(jìn)行了一系列脅迫試驗(yàn)，結(jié)果顯示IrrE提高了大腸桿菌的抗鹽脅迫、抗氧化脅迫以及抗高溫脅迫的能力；為研究IrrE在植物中的抗逆效果，Pan等又將IrrE基因轉(zhuǎn)入油菜中，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因油菜植株能夠在350 mmo/L NaCl處理下6周后正常開(kāi)花結(jié)子，而對(duì)照非轉(zhuǎn)基因油菜植株在相同條件下處理2周后死亡[7]。

但目前對(duì)IrrE基因在植物中是如何提高植株抵抗逆境脅迫能力的分子機(jī)理還知之甚少，相關(guān)研究報(bào)道也很少。先前的研究以轉(zhuǎn)IrrE基因油菜T0代植株為試驗(yàn)材料，其后代植株抵抗鹽脅迫的能力如何還不清楚。因此，本研究以轉(zhuǎn)IrrE基因油菜T3代植株為試驗(yàn)材料，以非轉(zhuǎn)基因油菜植株為對(duì)照，探討不同鹽濃度脅迫下IrrE基因過(guò)表達(dá)對(duì)油菜植株相關(guān)生理生化的影響，為充分了解過(guò)表達(dá)IrrE基因在植物抵抗鹽脅迫過(guò)程中的作用和在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用IrrE基因培育抗鹽作物新品種提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料培養(yǎng)與鹽脅迫處理

非轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）種子84100-18（玻里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系）由四川大學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，過(guò)表達(dá)IrrE轉(zhuǎn)基因T3代油菜種子由西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院極端環(huán)境生物資源與利用實(shí)驗(yàn)室以84100-18為受體材料遺傳轉(zhuǎn)化而得。將非轉(zhuǎn)基因油菜種子和轉(zhuǎn)基因油菜種子滅菌后分別接種在MS和含50 mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基上，催芽生根后分別播于塑料盆中，每盆2株幼苗，以蛭石 ∶營(yíng)養(yǎng)土=1 ∶3為基質(zhì)，MS營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，置于溫室[光周期，16 h光照、8 h黑暗；光照強(qiáng)度500 μmol/（m2·s）；溫度（25±4） ℃；相對(duì)濕度80%]下培養(yǎng)。

待油菜幼苗長(zhǎng)出5～6張真葉時(shí)進(jìn)行鹽脅迫處理，每個(gè)處理3盆（重復(fù)3次）。不同濃度NaCl處理分為7組：在1/2MS營(yíng)養(yǎng)液中分別加入0、100、150、200、250、300、350 mmol/L NaCl，溶液澆灌量約為200 mL，浸透培養(yǎng)基質(zhì)，盆底墊塑料托盤(pán)，以便及時(shí)將流出的鹽溶液倒回盆內(nèi)，防止鹽分流失。處理24 h后，采樣（選取植株由上到下第3張葉片，去除葉脈后，剪碎混勻），用于PCR和相應(yīng)生理生化指標(biāo)檢測(cè)。

1.2T3代轉(zhuǎn)基因油菜植株的PCR檢測(cè)

用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因油菜葉片的總DNA，以此為模板，以PBI121-IrrE載體的質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，以非轉(zhuǎn)基因植株為陰性對(duì)照進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR檢測(cè)上游引物IrrE-up：5′- ATCCCTGTTAAGCTCCCATTCG-3′以及下游引物IrrE-down：5′-GACGGGTTCGGGCATCAAA-3′。PCR反應(yīng)體系為20 μL：1 μL模板DNA，2 μL 10×Taq buffer，2 μL dNTPs，引物各1 μL，0.2 μL Taq聚合酶，加滅菌水補(bǔ)齊至終體積。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增片段用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3生理生化指標(biāo)的檢測(cè)

1.3.1粗酶液的提取稱(chēng)取2 g植物葉片，置于預(yù)冷的研缽中，加入少量的石英砂和預(yù)冷的4 mL 50 mmol/L磷酸緩沖液（pH值7.0，含1%PVP、0.1%巰基乙醇）于冰浴上研磨成勻漿，全部轉(zhuǎn)入5 mL干凈的離心管中，于4 ℃、13 000 g離心 10 min，將上清液分裝至干凈的1.5 mL離心管中，保存于 -20 ℃ 備用。

1.3.2抗氧化酶活性的檢測(cè)過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[8]，以1 min D470 nm變化001為1個(gè)酶活性單位[U/（g·min）]；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性的檢測(cè)采用氮藍(lán)四唑（NBT）法[9]，以抑制NBT光還原50%作為1個(gè)酶活性單位（U/g）；過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）活性的檢測(cè)采用H2O2法[10-11]，以25 ℃下100 s內(nèi)在反應(yīng)體系中分解50% H2O2的酶量作為1個(gè)酶活性單位 （U/g）。

1.3.3其他生理生化指標(biāo)的檢測(cè)丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的測(cè)定用硫代巴比妥酸（TBA）比色法[12]；細(xì)胞膜透性的測(cè)定用相對(duì)電導(dǎo)率（REC）法[13]；脯氨酸與可溶性糖含量的測(cè)定分別用酸性茚三酮比色法[14]和蒽酮比色法[15]。

1.4數(shù)據(jù)處理

采用SAS 8.0 和Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理及作圖。

2結(jié)果與分析

2.1IrrE基因的PCR檢測(cè)

對(duì)T3代轉(zhuǎn)基因油菜植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果（圖1）表明，轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA均擴(kuò)增出與陽(yáng)性質(zhì)粒（對(duì)照）同樣大小的目的片段（396 bp），而非轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA未擴(kuò)增出條帶。

2.2過(guò)表達(dá)IrrE基因提高油菜植株葉片抗氧化酶活性

隨著NaCl濃度的增加，轉(zhuǎn)基因油菜植株與非轉(zhuǎn)基因油菜植株的抗氧酶活性均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，但前者的抗氧酶活性高于后者的活性（圖2）。在0、100、150 mmol/L NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因油菜植株與非轉(zhuǎn)基因油菜植株P(guān)OD活性和SOD活性差異不顯著；但在200、250、300、350 mmol/L NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因油菜植株的POD活性和SOD活性均顯著高于非轉(zhuǎn)基因油菜植株，其中轉(zhuǎn)基因油菜植株的POD活性比非轉(zhuǎn)基因油菜植株分別高17.6%、17.9%、56.0%、572%，轉(zhuǎn)基因油菜植株的SOD活性比非轉(zhuǎn)基因油菜植株分別高出17.3%、46.0%、57.2%、54.3%。在0～150 mmol/L NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因油菜植株的CAT活性與非轉(zhuǎn)基因油菜植株差異不顯著；但在200、250、300、350 mmol/L NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因油菜植株的CAT活性顯著高于非轉(zhuǎn)基因油菜植株，分別高12.4%、22.6%、63.3%、104.0%。

2.3過(guò)表達(dá)IrrE基因提高油菜植株葉片在高鹽脅迫下細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力

在0～300 mmol/L NaCl脅迫下，盡管轉(zhuǎn)基因油菜植株可溶性糖含量與非轉(zhuǎn)基因油菜差異不顯著，但轉(zhuǎn)基因油菜植株的可溶性糖含量在不同濃度下都高于非轉(zhuǎn)基因油菜植株；在350 mmol/L NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因油菜植株的可溶性糖含量顯著高于非轉(zhuǎn)基因油菜植株，前者比后者高14.8%（圖3-A）。轉(zhuǎn)基因油菜植株的脯氨酸含量在250、300、350 mmol/L NaCl脅迫下極顯著地高于非轉(zhuǎn)基因油菜植株，分別高19.6%、532%、21.9%；在0～200 mmol/L NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因油菜植株與非轉(zhuǎn)基因油菜的脯氨酸含量差異不顯著，但轉(zhuǎn)基因油菜植株的脯氨酸含量仍然高于非轉(zhuǎn)基因油菜植株（圖3-B）。

2.4過(guò)表達(dá)IrrE基因提高油菜植株葉片在鹽脅迫下細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性

隨著鹽濃度的增加，轉(zhuǎn)基因油菜植株和非轉(zhuǎn)基因油菜植

株的MDA含量和REC均呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，但前者增加幅度小于后者（圖4）；在0、100 mmol/L NaCl脅迫下，二者的MDA含量和REC差異不顯著；在150、200、250、300、350 mmol/L NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因油菜植株的MDA含量和REC顯著低于非轉(zhuǎn)基因油菜植株，轉(zhuǎn)基因油菜植株的MDA含量分別低于非轉(zhuǎn)基因油菜植株20.0%、38.3%、23.8%、22.5%、20.8%（圖4-A），而轉(zhuǎn)基因油菜植株的REC分別低于非轉(zhuǎn)基因油菜植株13.2%、20.2%、22.2%、31.1%、252%（圖4-B）。

3結(jié)論與討論

鹽脅迫會(huì)使植物細(xì)胞形成滲透和離子脅迫，且細(xì)胞質(zhì)會(huì)積累一些小分子的有機(jī)物如脯氨酸、可溶性糖、甜菜堿等來(lái)緩解滲透脅迫[16-17]。在本研究中，在高濃度（250、300、350 mmol/L）NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株葉片的脯氨酸含量和可溶性糖含量均明顯高于對(duì)照，說(shuō)明過(guò)表達(dá)IrrE能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因植株葉片脯氨酸和可溶性糖量的積累，維持細(xì)胞內(nèi)外的滲透平衡，減少細(xì)胞因滲透脅迫而造成的功能降低。

非生物脅迫下，植物體內(nèi)形成大量的活性氧，如氫氧根負(fù)離子（OH—）、自由羥基（·OH）、過(guò)氧化氫（H2O2）等[18]。這些活性氧不及時(shí)清除就會(huì)損傷植物細(xì)胞，尤其是造成細(xì)胞質(zhì)膜的過(guò)氧化；相應(yīng)地，植物體內(nèi)有一個(gè)活性氧清除體系，產(chǎn)生的活性氧能及時(shí)被植物體內(nèi)抗氧化酶清除，這些抗氧化酶主要有SOD、CAT、POD、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）、谷胱甘肽還原酶（GR）、脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPX）等[19]。植物的抗氧化酶活性越高，清除活性氧的能力越強(qiáng)，植物抗非生物脅迫的能力就越強(qiáng)[20]。本研究中，在高濃度（200、250、300、350 mmol/L）NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株的抗氧化酶活性（SOD、CAT、POD）均明顯強(qiáng)于對(duì)照，而低濃度（100、150、200 mmol/L）NaCl脅迫下，差異雖不明顯，但轉(zhuǎn)基因的抗氧化酶活性均高于非轉(zhuǎn)基因。說(shuō)明過(guò)表達(dá)IrrE能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的抗氧化酶活性，增強(qiáng)植株清除活性氧的能力。這可能是由于IrrE基因作為一個(gè)全局調(diào)控因子，能調(diào)節(jié)油菜多種抗逆基因的高表達(dá)，如SOD、CAT基因等[7]。

在鹽脅迫下，植物葉片最先受到破環(huán)的是細(xì)胞膜，大量的活性氧導(dǎo)致質(zhì)膜過(guò)氧化產(chǎn)生MDA以及電解質(zhì)大量外滲，進(jìn)而細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性遭到破壞[21]。本研究中，高濃度（200、250、300 mmol/L）NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株MDA含量和REC均顯著低于非轉(zhuǎn)基因，說(shuō)明過(guò)表達(dá)IrrE通過(guò)增強(qiáng)抗氧化酶活性來(lái)清除高濃度鹽脅迫形成的活性氧，減輕質(zhì)膜的損傷程度，維持膜結(jié)構(gòu)的完整性。

Pan等最早報(bào)道油菜中過(guò)表達(dá)IrrE能提高轉(zhuǎn)基因植株在高鹽脅迫下的存活能力[7]；奉斌等也曾報(bào)道在煙草中過(guò)表達(dá)IrrE能提高轉(zhuǎn)基因植株耐旱能力[22]；童仕波等發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中過(guò)表達(dá)IrrE能提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鹽脅迫的耐受性[23]。本研究進(jìn)一步證明了轉(zhuǎn)IrrE基因油菜的后代T3在高鹽濃度脅迫下，過(guò)表達(dá)IrrE能夠提高轉(zhuǎn)基因油菜植株的抗鹽脅迫能力?？梢?jiàn)，IrrE在植物抵抗鹽脅迫和干旱脅迫中起重要作用，這為以后利用IrrE培育抗鹽作物新品種提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

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