仲義+王云鵬+代秀云+劉文國

摘要：從甲磺隆抗性結縷草植株中克隆得到乙酰乳酸合成酶基因（ALS），構建35S啟動子驅動的該基因的植物表達載體p33-ALS。用農桿菌介導的玉米萌動胚轉化方法轉化玉米種子，獲得抗除草劑的轉ALS基因玉米材料。結果表明，經(jīng)除草劑篩選共獲得抗性植株7株，陽性率為1.4%，T1代植株除草劑抗性試驗表明，轉基因植株能夠耐受住5%的甲磺隆溶液噴灑。分離得到的ALS基因導入玉米基因組后能夠極大地提高對甲磺隆的耐受能力。

關鍵詞：玉米；萌動胚；農桿菌；遺傳轉化

中圖分類號：S513；Q785 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）17-4001-04

Generating Herbicide Resistant Transgenic Plants in Maize with

Germinating Embryo as Explants

ZHONG Yi1， WANG Yun-peng2， DAI Xiu-yun1， LIU Wen-guo2

（1. Maize Research Institute， Jilin Academy of Agricultural Sciences， Gongzhuling 136100， Jilin， China； 2. College of Agriculture， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China）

Abstract： The plant expression vector p33-ALS driven by 35S promoter was constructed from the resistance of a short cycling zoysia plants originated from cloning ALS gene. The genetically modified maize with herbicide resistance ALS gene was obtained with agrobacterium mediated transformation of stirring of maize embryo into maize seeds. The results showed that the positive rate of the resistant 7 plants filtrated by way of herbicide was 1.4%. Herbicide resistance of the T1 generation plant showed that the transgenic plants tolerated a solution spray with 5% metsulfuron-methyl. The ALS gene isolated from this study after transferred into maize genome can greatly improve maize tolerance of metsulfuron-methyl.

Key words： maize； germinating embryo； agrobacterium tumefaciens； genetic transformation

雜草是危害農作物的主要生物脅迫之一，盡管其對玉米生長中后期不再產生影響，但早期仍需要進行除草。除草劑是玉米除草十分理想的選擇，盡管已有玉米專用性除草劑出現(xiàn)，但是對于多數(shù)單子葉雜草，其效果仍不理想，并且與草丁膦抗性相關的bar基因、與草甘膦抗性的EPSPS基因等許多除草劑基因均已被國外育種公司注冊并取得了專利保護，成為我國育種過程中進一步應用的障礙。乙酰乳酸合成酶（ALS）是植物和微生物中亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸合成途徑的第一種酶，不同的ALS的氨基酸序列的差異與磺酰脲類除草劑抗性具有很大的關系，多數(shù)植物的ALS對磺酰脲類除草劑較為敏感，目前已在擬南芥、細菌等中對此基因進行了克隆并對氨基酸序列和除草劑抗性的關系進行了研究[1，2]，但相關的專利保護不像bar基因、EPSPS基因那樣苛刻。

利用農桿菌侵染及基因槍轟擊等方法對玉米不同來源的外植體，諸如懸浮細胞[3]、幼胚[4]、幼穗[5，6]、莖尖[7-9]、成熟胚[10，11]等進行遺傳轉化。這些轉化方法往往需要消耗大量人力物力并有一定的基因型依賴性。由于適合進行組織培養(yǎng)的基因型不具備較好的農業(yè)性狀，因此給進一步的轉基因玉米新品種選育工作帶來較多阻礙。利用農桿菌介導玉米萌動胚[12，13]能夠較好地解決這一問題，因此適合針對農藝性狀好但組織培養(yǎng)體系尚未建立的玉米自交系的遺傳轉化工作。本研究利用農桿菌介導方法轉化玉米萌動胚的方法將克隆的ALS基因轉化到玉米基因組中，分析轉基因后對除草劑甲磺隆的抗性，為創(chuàng)建抗除草劑轉基因玉米新品種打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料：JVO16為吉林省農業(yè)科學院玉米研究所實驗室保存。結縷草（Zoysia japonica Steud.）種子購自花卉市場。

菌種質粒：質粒pCAMBIA3300、農桿菌EHA105為吉林省農業(yè)科學院玉米研究所實驗室保存。

試驗藥品：限制性內切酶、連接酶購自Promega公司，Trans Taq DNA Polymerase High Fidelity （HiFi） Taq酶購自北京全式金生物工程公司，膠回收試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司。200 bp ladder Marker購自加拿大MBI公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 抗甲磺隆ALS基因的獲得 取1 000粒野生型結縷草種子種植于花盆中，待植株生長至10 cm時噴灑1%甲磺隆溶液。取存活下來的植株，通過CTAB法提取植物總DNA。根據(jù)NCBI上已知的ALS基因序列設計引物Primer1、Primer2，通過PCR擴增獲得ALS基因。模板用根據(jù)已發(fā)表的PR10a啟動子序列（Genbank AB513331.1）設計的引物擴增。引物序列為：

Primer1：5′-CTCGAGATGGCCACCACCCCGACAAC-3′

Primer2：5′-CTCGAGCACTGAAGATATAATCTAAC-3′

PCR程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產物連入TA克隆載體pEAZY-T1，交由上海生工生物工程技術服務有限公司測序，并用DNAMAN和DNASIS軟件對其進行序列分析。

1.2.2 植物表達載體的構建 用Xho I將pEAZY-ALS上的ALS基因切下，連接到用相同酶切的p3300大片段上，經(jīng)Xho I酶切驗證正確后，命名為p33-ALS。

1.2.3 轉化和篩選 挑選500粒飽滿、無損傷的玉米種子，經(jīng)0.1%氯化汞浸泡消毒后，加入150 mL無菌水，室溫90 r/min振蕩12 h。將吸水膨脹種子進行劃胚處理后，加入15 mL OD值為1的農桿菌菌液，共培養(yǎng)48 h。將共培養(yǎng)后的種子播種在含有蛭石的營養(yǎng)土中，當玉米苗長至三葉一心期時，用0.5%的甲磺隆溶液噴灑篩選。篩選存活的玉米植株，經(jīng)PCR檢測表現(xiàn)陽性的植株移至大盆，繼續(xù)生長直至結實。

1.3 PCR檢測

采用CTAB法提取6葉期除草劑抗性玉米的總DNA，以此為模版進行PCR擴增，檢測ALS基因是否插入玉米基因組中。ALS基因檢測用的引物序列如下：

Primer3：5′-GGAGTGACGTTGGGGCATC-3′

Primer4：5′-ACTCGTGTGACGGCAGGAC-3′

預期擴增片段長度為526 bp。

PCR擴增總反應體系為25 μL，其中2×Taq PCR Master Mix（北京天根生物技術有限公司） 12.5 μL，上下游引物各1 μL（10 nmol/μL），DNA模板1 μL（100 ng/μL），ddH2O 9.5 μL。PCR擴增條件為：94 ℃預變性5 min；之后94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30個循環(huán)；最終72 ℃延伸8 min。試驗以未轉化植株的DNA為陰性對照，以質粒DNA為陽性對照，同時設立去離子水為模板的空白對照。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 除草劑抗性試驗

將非轉基因玉米和經(jīng)過PCR檢測為陽性的玉米植株后代種植于土壤中，待長至三葉一心期時，用0.5%、1.0%、2.5%、5.0%的甲磺隆溶液噴灑篩選分析除草劑抗性。

2 結果與分析

2.1 片段的克隆與序列分析

PCR產物經(jīng)電泳檢測，結果表明，成功獲得了與目的基因大小相符的約為2 kbp的DNA片段（圖1A）。片段插入TA克隆載體pEAZY-T1后，命名為pEAZY-ALS。測序結果表明，PCR擴增所獲得的ALS基因序列全長1 938 bp，與報道序列（GenBank accession number AB513331.1）有34個堿基的差異，同源性為98.6%，所編碼的氨基酸有3個位點發(fā)生了改變，經(jīng)與除草劑敏感型水稻、除草劑抗性水稻的ALS蛋白序列進行比較后發(fā)現(xiàn)，其中第549位、628位改變與其抗性產生相關，而第55位氨基酸的差異僅為進化中產生的隨機突變（圖1B）。與玉米ALS蛋白序列比較結果表明兩者之間有88.9%的同源性，而玉米內源的ALS蛋白中第549位、第628位氨基酸與除草劑敏感型水稻一致，屬于除草劑敏感型。為進一步進行遺傳轉化提高玉米除草劑抗性提供了依據(jù)。

2.2 p33-ALS 植物表達載體的構建

如圖2A所示，通過亞克隆將ALS基因替換p3300上的bar基因。用XhoⅠ酶切pEAZY-ALS和p3300，分別回收pEAZY-ALS酶切產物中的小片段和p3300酶切產物中的大片段，用T4 DNA連接酶連接轉化大腸桿菌。用XhoⅠ酶切鑒定釋放出長約1.98 kbp的片段（圖2B），最終經(jīng)測序證實插入方向正確的重組載體命名為p33-ALS。

2.3 除草劑抗性植株的獲得及PCR檢測

從圖3A所示的植物株中經(jīng)過篩選共計獲得抗除草劑玉米植株7株（圖3B），經(jīng)PCR擴增檢測的結果如圖3C所示，獲得的7株抗性植株均為陽性植株，轉化率為1.4%。

2.4 除草劑抗性試驗

經(jīng)過不同的甲磺隆溶液噴灑1周后，0.5%甲磺隆溶液即可對野生型玉米植株產生影響，由圖4可知，野生型植株在用5%甲磺隆溶液噴灑后1周即完全死亡，而T1代PCR陽性的轉基因植株幾乎完全不受影響。

3 結論與討論

本研究分離得到的ALS基因導入玉米基因組后能夠極大地提高對甲磺隆的耐受能力。T1代的除草劑試驗表明外援基因已整合到基因組中并能夠順利的遺傳到后代。對該基因所編碼的氨基酸序列進行分析發(fā)現(xiàn)，第549位W轉變?yōu)長、第628位S轉變?yōu)镮，與水稻ALS蛋白對甲磺隆抗性的突變結果一致，進一步證實了這兩個位點與甲磺隆抗性相關，為進一步研究該基因功能提供佐證。

盡管利用植物組織培養(yǎng)等方法能夠獲得轉基因植株，但是往往由于長時間的繼代、篩選等過程導致再生植株出現(xiàn)各種非遺傳方面的變異。而農桿菌介導的萌動胚轉化法，集傳統(tǒng)的農桿菌介導法和不依賴于組織培養(yǎng)轉化法的優(yōu)點于一身，是玉米轉基因方法中優(yōu)良的備選方案。因此，本試驗選用了該方法作為創(chuàng)建轉基因玉米種質的手段。

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