王 磊，楊承槐，劉 瑩

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

1 概 況

自1981年，World Health Organization(WHO) 生物制品標(biāo)準(zhǔn)化專(zhuān)家委員會(huì)(Expert Committee on Biological Standardization，ECBS)第一次批準(zhǔn)使用純凈的傳代細(xì)胞系用于骨髓灰質(zhì)炎疫苗的生產(chǎn)后，針對(duì)傳代細(xì)胞系作為生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)的安全性爭(zhēng)論已經(jīng)持續(xù)了近半個(gè)世紀(jì)[1]。對(duì)于如何評(píng)價(jià)作為生產(chǎn)用基質(zhì)的傳代細(xì)胞系是否安全依然是目前各國(guó)藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)關(guān)心和討論的重點(diǎn)問(wèn)題之一。傳代細(xì)胞系的安全性主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：一是細(xì)胞本身是否純凈，有無(wú)攜帶外源因子；二是細(xì)胞及其組分(包括外源因子、細(xì)胞DNA和細(xì)胞裂解物等)是否具有致瘤性特性[2]。傳代細(xì)胞系失去了細(xì)胞接觸抑制的特性，具有體外無(wú)限增殖的能力，存在發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化和致瘤性風(fēng)險(xiǎn)。傳代細(xì)胞系自身的致瘤性與否會(huì)直接關(guān)系到作為生產(chǎn)用基質(zhì)的生物制品種類(lèi)、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定等諸多方面[3-4]。在2010年第61屆生物制品標(biāo)準(zhǔn)化專(zhuān)家委員會(huì)發(fā)布了關(guān)于生物制品生產(chǎn)用動(dòng)物源性細(xì)胞基質(zhì)技術(shù)指南(簡(jiǎn)稱技術(shù)指南)即WHO動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)生物醫(yī)藥產(chǎn)品和細(xì)胞庫(kù)特性的評(píng)價(jià)建議(Recommendations for the Evaluation of Animal Cell Culture as Substrates for the Manufacture of Biological Medicinal Products and for the Characterization)[5]。2013年，ECBS對(duì)其進(jìn)行了修訂，發(fā)布了最新版本的技術(shù)指南。該技術(shù)指南旨在為各國(guó)藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)制定關(guān)于生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù)的檢定與特性描述的相關(guān)技術(shù)要求時(shí)提供必要參考。各國(guó)家可以結(jié)合自身情況，對(duì)技術(shù)指南內(nèi)容做必要修改或者直接采納作為本國(guó)技術(shù)要求[6]。下面對(duì)WHO技術(shù)指南中關(guān)于生產(chǎn)用傳代細(xì)胞系致瘤性檢驗(yàn)的相關(guān)要求進(jìn)行介紹并同我國(guó)現(xiàn)行獸藥典中的致瘤性檢驗(yàn)要求進(jìn)行梳理和比較，以期為完善我國(guó)生產(chǎn)用傳代細(xì)胞系致瘤性評(píng)價(jià)的技術(shù)要求提供參考。

2 WHO技術(shù)指南與現(xiàn)行獸藥典中關(guān)于致瘤性檢驗(yàn)方法和檢測(cè)對(duì)象的要求

由于WHO技術(shù)指南是生物制品生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)的通用要求，因此，具有普適性，適用對(duì)象比較寬泛，主要包括新建二倍體細(xì)胞系(除公認(rèn)無(wú)致瘤性細(xì)胞(如WI-38、MRC-5、FRhL-2))、傳代細(xì)胞系(除了雜交瘤細(xì)胞和公認(rèn)有致瘤性細(xì)胞系(如BHK-21、CHO、HEK293、CL27))、干細(xì)胞系。致瘤性檢測(cè)方法分為兩類(lèi)，一是動(dòng)物體內(nèi)成瘤法(簡(jiǎn)稱體內(nèi)法)；二是動(dòng)物體外檢測(cè)方法(軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn))。我國(guó)獸用生物制品采用原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞系作為生產(chǎn)基質(zhì)。原代細(xì)胞是公認(rèn)不存在致瘤性的風(fēng)險(xiǎn)的基質(zhì)。因此，我國(guó)獸藥典中致瘤性檢驗(yàn)的對(duì)象只包括了傳代細(xì)胞系，并采用動(dòng)物體內(nèi)成瘤法作為檢驗(yàn)方法[7]。

3 動(dòng)物體內(nèi)成瘤法

動(dòng)物體內(nèi)成瘤法是評(píng)價(jià)細(xì)胞系致瘤性與否的標(biāo)準(zhǔn)方法。該方法是按照規(guī)定選擇動(dòng)物的種類(lèi)，以一定量的活細(xì)胞培養(yǎng)物或者裂解產(chǎn)物接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，培養(yǎng)一段時(shí)間后，通過(guò)剖檢和病理學(xué)檢查是否有腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)來(lái)判定細(xì)胞的致瘤性。動(dòng)物體內(nèi)法具有檢驗(yàn)敏感性好、判定結(jié)果直觀等諸多優(yōu)點(diǎn)，是細(xì)胞致瘤性檢驗(yàn)的經(jīng)典方法。

表1中對(duì)現(xiàn)行獸藥典和WHO技術(shù)指南收錄的采用動(dòng)物體內(nèi)成瘤法進(jìn)行致瘤性檢驗(yàn)的要求進(jìn)行了簡(jiǎn)單梳理。WHO技術(shù)指南采用動(dòng)物體內(nèi)成瘤法評(píng)價(jià)細(xì)胞系致瘤性時(shí)，分為了兩個(gè)層次進(jìn)行評(píng)價(jià)即成瘤性檢驗(yàn)和致瘤性檢驗(yàn)。成瘤性檢驗(yàn)是對(duì)傳代細(xì)胞系活培養(yǎng)物在動(dòng)物體內(nèi)成瘤能力的檢查，是細(xì)胞系本身生物特性體現(xiàn)。在成瘤性檢驗(yàn)中產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞一部分來(lái)自接種的待檢細(xì)胞活培養(yǎng)物，另一部分則來(lái)自待檢細(xì)胞誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)胞形成的。當(dāng)某種特定的細(xì)胞系成瘤性檢驗(yàn)呈陽(yáng)性時(shí)，即開(kāi)展致瘤性檢驗(yàn)。WHO技術(shù)指南要求的致瘤性檢驗(yàn)是檢查細(xì)胞組分(包括細(xì)胞裂解物、細(xì)胞DNA和外源因子等)在動(dòng)物體內(nèi)是否可以誘導(dǎo)形成腫瘤，因此，致瘤性檢驗(yàn)中產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞完全由待檢細(xì)胞組分中包含的致瘤因子誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)胞形成。

表1 現(xiàn)行獸藥典與WHO技術(shù)指南在采用動(dòng)物體內(nèi)成瘤法進(jìn)行致瘤性檢驗(yàn)的要求[6-7]Tab 1 Requirements of Current Veterinary Pharmacopoeia and WHO technical guidelines for tumorigenicity test by in vivo[6-7]

現(xiàn)行版獸藥典的致瘤性檢驗(yàn)要求大致對(duì)應(yīng)了WHO技術(shù)指南中成瘤性檢驗(yàn)的方法。但是，目前在我國(guó)獸用滅活疫苗的研發(fā)和生產(chǎn)當(dāng)中，使用了大量的成瘤性檢驗(yàn)陽(yáng)性的細(xì)胞(如BHK-21、PK-15、Marc-145細(xì)胞等)作為生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)[8-9]。而現(xiàn)有方法還不能全面的了解和評(píng)估這些細(xì)胞在破碎裂解后是否依然會(huì)攜帶致瘤因子誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生腫瘤。因此，建議參照WHO技術(shù)指南的方法，將成瘤陽(yáng)性細(xì)胞檢驗(yàn)進(jìn)一步細(xì)化，評(píng)價(jià)成瘤陽(yáng)性細(xì)胞組分(破碎裂解細(xì)胞或者細(xì)胞DNA等)是否完全不會(huì)攜帶致瘤因子，同時(shí)評(píng)價(jià)對(duì)生物制品的滅活工藝是否可以完全消除成瘤陽(yáng)性或致瘤陽(yáng)性細(xì)胞造成的潛在致瘤風(fēng)險(xiǎn)。

3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用 目前在成瘤性/致瘤性實(shí)驗(yàn)規(guī)定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物主要包括成年無(wú)胸腺小鼠、新生無(wú)胸腺小鼠和用抗胸腺血清/球蛋白處理的小鼠(新生乳鼠、倉(cāng)鼠或8～10 g小鼠)。表2對(duì)于幾種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在致瘤性檢驗(yàn)中的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了比較。

表2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型在致瘤性檢驗(yàn)中的優(yōu)缺點(diǎn)比較Tab 2 Comparison of advantages and disadvantages of several experimental animal models in tumorigenicity test

WHO技術(shù)指南中成瘤性檢驗(yàn)只要求成年的無(wú)胸腺小鼠。我國(guó)獸藥典除此之外還補(bǔ)充了用抗胸腺血清處理的新生乳鼠或8～10 g小鼠亦可作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物并對(duì)以上動(dòng)物任選其一。不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)同一因素的反應(yīng)雖然往往是相似的, 但有它的特殊性，因此，檢驗(yàn)中常要選用那些對(duì)待檢細(xì)胞最敏感的動(dòng)物作為檢驗(yàn)對(duì)象。成年無(wú)胸腺小鼠容易獲得，可以滿足多數(shù)常用生產(chǎn)用細(xì)胞的致瘤性檢驗(yàn)。而抗胸腺血清/球蛋白處理的小鼠雖不易獲得，但是是檢測(cè)待檢細(xì)胞癌變轉(zhuǎn)移潛力的敏感模型，可以用于檢測(cè)有潛在形成轉(zhuǎn)移瘤風(fēng)險(xiǎn)的細(xì)胞系[7]。因此，我國(guó)獸藥典在選用動(dòng)物模型對(duì)傳代細(xì)胞系進(jìn)行致瘤性檢驗(yàn)時(shí),補(bǔ)充了其他可選擇的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，沒(méi)有局限于無(wú)胸腺小鼠, 是有其科學(xué)性的。

3.2 結(jié)果判定 WHO技術(shù)指南的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)注重在一定時(shí)間內(nèi)對(duì)注射部位產(chǎn)生的腫塊動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)過(guò)程的監(jiān)測(cè)。腫塊如果在觀察期內(nèi)可以自行消退或經(jīng)雙向測(cè)量判斷為非進(jìn)行性結(jié)節(jié)，那么判定為不具有致瘤性。10只動(dòng)物至少有兩只在注射部位或轉(zhuǎn)移部位形成腫瘤，判定為致瘤。此外，在分析實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤的形成時(shí)，要求腫塊的組織病理學(xué)和基因分型結(jié)果應(yīng)接種細(xì)胞一致，就避免了由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型自身的免疫缺陷造成自發(fā)形成腫瘤對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的干擾，因此，更加科學(xué)。獸藥典相比之下更加注重判定時(shí)間點(diǎn)的檢查結(jié)果，3～5周時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行剖檢，即使有一只動(dòng)物出現(xiàn)非進(jìn)行性結(jié)節(jié)沒(méi)有完全消退的情況，也應(yīng)判定為有致瘤性，因此，獸藥典結(jié)果判定更加嚴(yán)格。

4 體外檢測(cè)方法

雖然動(dòng)物體內(nèi)成瘤法是致瘤性檢驗(yàn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但依然存在實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)過(guò)程復(fù)雜、檢驗(yàn)成本較高、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。此外，用于體內(nèi)法成瘤實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物模型體溫37±1 ℃并不適用于所有傳代細(xì)胞系的常規(guī)培養(yǎng)溫度(如昆蟲(chóng)細(xì)胞SF9培養(yǎng)溫度為28 ℃，禽類(lèi)細(xì)胞DF-1的最佳培養(yǎng)溫度為39 ℃)，針對(duì)這類(lèi)細(xì)胞動(dòng)物體內(nèi)法成瘤實(shí)驗(yàn)并不能全面的反映出細(xì)胞自身的致瘤特性。因此，WHO技術(shù)指南以動(dòng)物體內(nèi)成瘤法作為標(biāo)準(zhǔn)方法的基礎(chǔ)上，還增加了一些體外檢測(cè)方法加以輔助，以對(duì)特定細(xì)胞的致瘤性與否進(jìn)行綜合判定。

軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)作為WHO技術(shù)指南推薦體外檢測(cè)方法可檢測(cè)細(xì)胞的致瘤性。該方法也是中國(guó)藥典以及歐洲藥典的推薦方法[10-11]。其利用了惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞伸展性差、接觸抑制消失，并不具備錨定依賴性，可以在軟瓊脂內(nèi)增殖的原理。也常被用于腫瘤細(xì)胞的分離純化、單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的克隆篩選和抗腫瘤藥物的體外抑瘤活性的評(píng)價(jià)[12]。由于軟瓊脂克隆法過(guò)于敏感，并且其結(jié)果與動(dòng)物體內(nèi)成瘤法的結(jié)果的一致性和相關(guān)性還需進(jìn)一步驗(yàn)證，因此，該方法只能作為檢測(cè)某些不適用于動(dòng)物體內(nèi)成瘤法檢驗(yàn)致瘤性的特定細(xì)胞系的補(bǔ)充替代方法。

5 其他問(wèn)題及建議

WHO動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)生物醫(yī)藥產(chǎn)品和細(xì)胞庫(kù)特性的評(píng)價(jià)建議，對(duì)生物制品生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)的檢定和安全性評(píng)價(jià)提供了非常有意義的參考。因此,建議根據(jù)WHO技術(shù)指南中采用動(dòng)物體內(nèi)成瘤法進(jìn)行致瘤性檢驗(yàn)的要求，結(jié)合我國(guó)實(shí)際情況對(duì)下一版獸藥典中對(duì)傳代細(xì)胞系致瘤性檢驗(yàn)的要求進(jìn)行進(jìn)一步細(xì)化完善。由于，目前沒(méi)有一種方法可以全面客觀的評(píng)估所有傳代細(xì)胞系的致瘤性風(fēng)險(xiǎn)。針對(duì)特定的細(xì)胞系根據(jù)其特點(diǎn)選擇適合的檢驗(yàn)方法顯得尤為重要。因此，建議增加適當(dāng)?shù)捏w外檢測(cè)方法作為補(bǔ)充評(píng)價(jià)的方法。

目前在國(guó)內(nèi)，新獸用生物制品研發(fā)過(guò)程中對(duì)于生產(chǎn)用傳代細(xì)胞系的致瘤性評(píng)價(jià)都是由研發(fā)單位自主完成。從最大限度降低農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)的角度考慮，建議對(duì)于初檢成瘤性陽(yáng)性的特定細(xì)胞，應(yīng)送交國(guó)家指定機(jī)構(gòu)完成進(jìn)一步的安全性評(píng)價(jià)，以判定是否可以用于特定生物制品的生產(chǎn)。

以傳代細(xì)胞系作為生產(chǎn)基質(zhì)的獸用生物制品在新上市監(jiān)測(cè)期內(nèi)，應(yīng)要求研發(fā)、生產(chǎn)企業(yè)收集新獸藥的致瘤性風(fēng)險(xiǎn)信息資料。獸藥管理部門(mén)也應(yīng)與檢疫部門(mén)、畜牧企業(yè)、屠宰企業(yè)和寵物醫(yī)院聯(lián)動(dòng)，定期開(kāi)展經(jīng)濟(jì)動(dòng)物和伴侶動(dòng)物的腫瘤病流行病學(xué)調(diào)查，匯總相關(guān)數(shù)據(jù)，以便綜合分析研判疫苗用藥與腫瘤發(fā)生的相關(guān)性，對(duì)成品獸用疫苗以及生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)安全性評(píng)價(jià)方法的適用性、可行性提供技術(shù)參考,以最大限度的保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量的安全。