朱明媛，劉 靜，李艷玲，董建偉，黃 韜，李 潤

(唐山怡安生物工程有限公司，河北唐山 063020)

犬細小病毒病(Canine parvovirus disease，CPVD)是由犬細小病毒(Canine parvovirus，CPV)引起的犬的一種急性高度接觸性傳染病，與病犬接觸后100%感染，致死率高達70%[1]。該病既嚴重威脅家養(yǎng)寵物的健康，又對我國養(yǎng)犬業(yè)和野生動物保護業(yè)構(gòu)成較大危害。犬細小病毒病目前沒有特效藥物，除依靠動物自身的免疫系統(tǒng)抵抗外，接種疫苗是預(yù)防犬細小病毒感染的最有效方法?；钜呙纭缁钜呙?、弱毒疫苗均有報道能一定程度預(yù)防犬細小病毒病[2-4]，目前國內(nèi)常用弱毒疫苗預(yù)防犬細小病毒病，但弱毒疫苗通常因母源抗體干擾發(fā)生免疫失敗，接種后動物可長期排毒，存在毒力返強風險。犬細小滅活疫苗具備免疫原性而不具有致病性，接種后動物能產(chǎn)生免疫應(yīng)答，達到保護作用，越來越受到科研工作者的青睞，但制備滅活疫苗對抗原的滴度要求很高，所以獲得高產(chǎn)量、高質(zhì)量的抗原是實現(xiàn)犬細小滅活疫苗產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)。

目前國內(nèi)報道的獲得犬細小病毒的方法主要有轉(zhuǎn)瓶法、雞胚法，鮮見有利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)犬細小病毒的報道。傳統(tǒng)培養(yǎng)工藝培養(yǎng)病毒普遍存在病毒滴度低、批間差大、勞動力成本高、易污染等問題[5-6]，因此找到一種新的培養(yǎng)犬細小病毒的方法頗為急切。本文利用微型生物反應(yīng)器及NBS反應(yīng)器摸索培養(yǎng)犬細小病毒YA-16-C66株最佳工藝，并將利用該工藝生產(chǎn)的抗原同傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶工藝產(chǎn)品做對比，以期為犬細小病毒的高產(chǎn)、高質(zhì)培養(yǎng)提供一種新的可行方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與病毒 F81細胞，唐山怡安生物工程有限公司馴化、保藏；犬細小病毒YA-16-C66株，唐山怡安生物工程有限公司篩選、保藏。

1.1.2 主要溶液與試劑 199培養(yǎng)基，天信合生物科技有限公司；新生牛血清，武漢三利生物科技有限公司；β-丙內(nèi)酯(BPL)，德國SERVA；MONTANIDE GEL 02，賽彼科(上海)特殊化學品有限公司。

1.1.3 載體 聚酯纖維紙片載體，上海楚怡生物科技有限公司。

1.1.4 儀器設(shè)備 微型轉(zhuǎn)管生物反應(yīng)器，杭州安普生物工程有限公司；CO2培養(yǎng)箱，三洋MCO-15AC；BioFlo 310型生物反應(yīng)器(5L)，美國NBS生物工程公司；SBA生化分析儀，濟南延和生物科技有限公司。

1.1.5 實驗動物 比格犬，北京瑪斯生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 F81細胞的最佳接種密度確定 利用微型生物反應(yīng)器，內(nèi)含0.6 g聚酯纖維紙片載體。培養(yǎng)條件為：37.0 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基為1%新生牛血清的199培養(yǎng)基，分別按照0.5×107/g、1.5×107/g、2.5×107/g密度接種細胞。每個密度平行設(shè)置9支。為了確保細胞增殖不受營養(yǎng)及代謝產(chǎn)物的影響，培養(yǎng)基每24 h更換一次，并測定殘?zhí)菨舛?。?4 h取一支轉(zhuǎn)管，將載體用0.25%胰酶消化后計數(shù)，分析細胞密度與葡萄糖消耗之間的關(guān)系。

1.2.2 犬細小病毒YA-16-C66株最佳接種劑量確定 利用微型生物反應(yīng)器，以1.5×107/g密度接種細胞，同時以不同感染復(fù)數(shù)(MOIs：0.05、0.1、0.2、0.4)接種病毒。每個接毒劑量平行設(shè)置9支，將微型反應(yīng)器置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。接毒后每24 h完全換液，測定葡萄糖消耗和上清液的病毒含量TCID50，TCID50測定方法參照《中國獸藥典》[7]。每24 h取一支轉(zhuǎn)管，將載體用0.25%胰酶消化后計數(shù)，直到紙片載體上細胞幾乎全部脫落時結(jié)束培養(yǎng)。結(jié)合病毒含量和細胞病變情況，確定犬細小病毒YA-16-C66株最佳接種劑量。

1.2.3 犬細小病毒YA-16-C66株生物反應(yīng)器培養(yǎng)工藝優(yōu)化 按照工藝流程，將150 g紙片載體裝入5L NBS生物反應(yīng)器中，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后備用。將生長成良好致密單層的F81細胞制成懸液，以1.5×107/g密度接種，犬細小病毒YA-16-C66株用培養(yǎng)基稀釋后，以感染復(fù)數(shù)0.05 MOI接種。培養(yǎng)基為含1%新生牛血清的199培養(yǎng)基，培養(yǎng)參數(shù)設(shè)置為37 ℃，pH7.2，溶氧50%，攪拌速度50 r/min，24 h后開啟灌流。1#反應(yīng)器溫度維持在37.0 ℃；2#反應(yīng)器培養(yǎng)溫度在接種細胞48 h后降至35.0 ℃。24 h開始每天取樣測定葡萄糖消耗，根據(jù)糖耗及細胞病變清情況調(diào)整灌流速度，使反應(yīng)器內(nèi)葡萄糖濃度控制在0.5 g/L以上。48 h開始收獲并每天測定病毒含量TCID50，直到紙片載體上細胞幾乎全部脫落時結(jié)束培養(yǎng)，測定總病毒含量TCID50。經(jīng)過3批次驗證，比較兩種不同溫度培養(yǎng)對犬細小病毒YA-16-C66株產(chǎn)毒質(zhì)量的影響，確定利用F81細胞生產(chǎn)犬細小病毒YA-16-C66株的紙片載體培養(yǎng)工藝。

1.2.4 反應(yīng)器與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)犬細小病毒YA-16-C66株工藝比較

1.2.4.1 紙片載體培養(yǎng)工藝 按照1.2.3確定的工藝，在5L生物反應(yīng)器中連續(xù)培養(yǎng)3批病毒。當糖耗降低，紙片載體上細胞幾乎全部脫落時結(jié)束培養(yǎng)，收獲上清液，測定病毒含量TCID50。

1.2.4.2 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝 將生長成致密單層的F81細胞消化成懸液，與稀釋過的犬細小病毒YA-16-C66株同步接入3L轉(zhuǎn)瓶，每批次使用10個3L轉(zhuǎn)瓶。病毒接種劑量為0.05 MOI，培養(yǎng)溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)瓶機轉(zhuǎn)速設(shè)置為10 r/h。當細胞病變達到80%～90%(CPE)以上時，收獲病毒液，測定病毒含量TCID50。

1.2.4.3 犬細小病毒YA-16-C66株HI效價測定將反應(yīng)器與轉(zhuǎn)瓶獲得的犬細小病毒YA-16-C66株分別經(jīng)濃縮、β-丙內(nèi)酯滅活，加入10%比例的MONTANIDE GEL 02，依據(jù)濃縮液TCID50結(jié)果制成抗原含量為107.0TCID50/100μL、符合質(zhì)量標準的犬細小病毒滅活疫苗，產(chǎn)品名稱依據(jù)抗原生產(chǎn)批次依次命名為CPV-C1910-001、CPV-C1911-002、CPV-C1912-003。

將6～8周齡的犬細小病毒抗體陰性、健康的比格犬分為6組，每組7只。取5只按0、7日免疫程序免疫，每只1 mL/次，作免疫組；2只不免疫，作對照組。首免后28日采血，依據(jù)《獸醫(yī)微生物學實驗指導(dǎo)》[8]進行血清抗體效價測定。

2 結(jié) 果

2.1 F81細胞最佳接種密度 以不同密度接種，F(xiàn)81細胞最大密度差異較小，但達到最大密度的時間不同，如圖1所示。按0.5×107/g接種時，細胞增長較慢，到168 h細胞達到最大量。按2.5×107/g接種細胞比按1.5×107/g接種細胞提前一天達到最大密度，但達到最大密度后糖耗下降較快。按1.5×107/g接種時，F(xiàn)81細胞在紙片載體上生長和糖耗關(guān)系如圖2所示，細胞生長與糖耗呈正相關(guān)，培養(yǎng)120 h后，細胞從9.0×106增加到8.92×107，糖耗最大達到3.58 mg/mL。因此，確定F81細胞最佳接種密度為1.5×107/g。

圖1 不同接種密度葡萄糖消耗曲線Fig 1 Glucose consumption curve of different inoculation densities

圖2 初始接種密度為1.5×107/g時的糖耗與細胞總量關(guān)系Fig 2 The relationship between glucose consumption and cell density with the initial concentration densities was 1.5×107/g

2.2 犬細小病毒YA-16-C66株最佳接種劑量不同感染復(fù)數(shù)(MOIs：0.05、0.1、0.2、0.4)接毒對生物反應(yīng)器中犬細小病毒YA-16-C66株擴增的影響如圖3所示，按0.05 MOI與0.1 MOI接毒，病毒達最大增殖能力的時間分別為96 h和72 h，且維持時間較長；高于0.1 MOI接種病毒時，細胞病變過快，細胞維持時間短，導(dǎo)致最終病毒滴度下降較快。由圖4、圖5可知，犬細小病毒YA-16-C66株病毒含量與糖耗呈正相關(guān)，四種接毒劑量的收獲液病毒含量均能達到106.0TCID50/100μL以上。綜合考慮，確定犬細小病毒YA-16-C66株接毒劑量為0.05 MOI。

圖3 按不同MOI接種病毒的糖耗曲線Fig 3 Glucose consumption curve of virus inoculation according to different MOI

圖4 按0.05 MOI接種病毒時的糖耗與病毒含量關(guān)系Fig 4 The relationship between glucose consumption and lgTCID50 with the virus inoculated at 0.05 MOI

圖5 按不同MOI接種時收獲液的病毒含量Fig 5 The lgTCID50 in harvest fluid inoculated with different MOI

2.3 生物反應(yīng)器培養(yǎng)工藝優(yōu)化 兩種溫度不同時間收獲液病毒含量TCID50結(jié)果如圖6所示，1#反應(yīng)器收獲液病毒含量在72 h達到峰值，為107.7TCID50/100μL，但病毒含量下降較快，96 h降為106.8TCID50/100μL。2#反應(yīng)器收獲液病毒含量達到峰值的時間為96 h，且到120 h病毒含量仍能維持在107.4TCID50/100μL，溫度適當降低能維持細胞較長存活時間，對總病毒含量的提升更有利。綜合分析，確定犬細小病毒YA-16-C66株反應(yīng)器培養(yǎng)工藝為：采用同步接毒法，培養(yǎng)基為含1%新生牛血清的199溶液，細胞接種密度為1.5×107/g，接毒劑量為0.05 MOI，在pH 7.2條件下，37.0 ℃培養(yǎng)48 h后降溫到35.0 ℃繼續(xù)培養(yǎng)72 h，且待細胞病變達到80%～90%時收獲上清液。

圖6 不同溫度下犬細小病毒YA-16-C66株增值曲線Fig 6 Proliferation curve of YA-16-C66 strain of Canine Parvovirus at different temperatures

2.4 反應(yīng)器與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)犬細小病毒YA-16-C66株工藝比較 3批次反應(yīng)器與轉(zhuǎn)瓶收獲液病毒含量和總量結(jié)果如表1：接毒后反應(yīng)器中細胞能維持4～5 d，收獲液病毒含量在107.6～107.8TCID50/100μL之間，收獲液體積約為10.5 L；轉(zhuǎn)瓶系統(tǒng)能維持4 d，收獲液產(chǎn)量約為3 L，收獲液病毒含量在105.9～106.5TCID50/100μL之間。反應(yīng)器比轉(zhuǎn)瓶收獲液病毒含量高1.1～1.9 lgTCID50/100μL；相同培養(yǎng)面積，反應(yīng)器所得病毒總量是轉(zhuǎn)瓶所得病毒總量的2.8～18.5倍。

表1 反應(yīng)器與轉(zhuǎn)瓶收獲液病毒含量和產(chǎn)量Tab 1 The content and yield of virus in the reactor and the spinner harvester

2.5 犬細小病毒YA-16-C66株HI抗體效價測定 3批次反應(yīng)器與轉(zhuǎn)瓶工藝產(chǎn)品HI抗體效價結(jié)果如表2：所有試驗犬只免疫28 d的血清凝集效價均≥1∶896，能達到有效保護，同時對照組犬只的血清HI效價均顯示為1∶10，即無抗體產(chǎn)生。

表2 反應(yīng)器與轉(zhuǎn)瓶工藝產(chǎn)品HI抗體效價Tab 2 HI antibody titer of the reactor and spinner technology products

3 分析與討論

3.1 F81細胞培養(yǎng)載體 對于貼壁細胞而言，傳統(tǒng)的小型培養(yǎng)容器有培養(yǎng)瓶、細胞工廠、轉(zhuǎn)瓶等，利用反應(yīng)器培養(yǎng)貼壁細胞一般借助于微載體和紙片載體。相比于培養(yǎng)瓶和細胞工廠的靜置培養(yǎng)，轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)具有結(jié)構(gòu)簡單、技術(shù)成熟的特點，而且細胞接種在旋轉(zhuǎn)的圓柱狀瓶中，培養(yǎng)過程中轉(zhuǎn)瓶不停旋轉(zhuǎn)，使細胞交替接觸營養(yǎng)液并進行空氣交換，更有利于細胞生長。因為重復(fù)性好，放大只需要簡單的增加轉(zhuǎn)瓶數(shù)量，轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)常用于小量培養(yǎng)到大規(guī)模培養(yǎng)的過渡階段，或作為生物反應(yīng)器接種細胞的一種途徑。

紙片載體是順應(yīng)反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)而發(fā)展起來的細胞培養(yǎng)載體，相對于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)，利用反應(yīng)器進行紙片載體培養(yǎng)細胞具有節(jié)省勞動力、占地空間小，單位體積提供細胞生長的表面積大，細胞生長密度高，培養(yǎng)時能實時監(jiān)測并控制環(huán)境條件等優(yōu)點。紙片載體多層張力結(jié)構(gòu)能保證培養(yǎng)基與細胞充分接觸，培養(yǎng)基流過載體層，攪拌剪切力和通氣氣泡對細胞生長不產(chǎn)生影響，更有利于細胞生長[9]。在5L NBS反應(yīng)器中，150 g紙片載體能提供細胞生長的表面積為2.25×105cm2，相當于150個3L轉(zhuǎn)瓶提供的表面積，根據(jù)糖耗與細胞生長之間的關(guān)系，F(xiàn)81細胞在5L反應(yīng)器中生長的最大量能達到3.02×1010/g，而具有同樣生長面積的轉(zhuǎn)瓶中F81細胞最多能達4.90×109，相差6倍。

3.2 F81細胞培養(yǎng)犬細小病毒工藝 利用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)病毒屬于勞動密集型方法，需要眾多人員，步驟繁瑣，比較容易發(fā)生污染，而且轉(zhuǎn)瓶單位體積產(chǎn)量較低，培養(yǎng)過程中環(huán)境差異及人員操作誤差常導(dǎo)致不同批次毒價不穩(wěn)定[10]。

利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)F81細胞，可根據(jù)細胞生長特性實時監(jiān)測與調(diào)控溫度、pH、溶氧等參數(shù)，細胞密度和活力高于轉(zhuǎn)瓶或者固定的平面等培養(yǎng)系統(tǒng)。隨著細胞灌流技術(shù)的發(fā)展，對于細胞培養(yǎng)與病毒生產(chǎn)條件不一致的工藝，降低培養(yǎng)溫度，提高代謝所需物質(zhì)，最終能有效提高病毒的產(chǎn)量與質(zhì)量[11-12]。利用5L反應(yīng)器與3L轉(zhuǎn)瓶同時培養(yǎng)犬細小病毒YA-16-C66株，生物反應(yīng)器收獲液病毒含量均在107.0TCID50/100μL以上，而轉(zhuǎn)瓶收獲液病毒含量從105.9TCID50/100μL到106.5TCID50/100μL；相同培養(yǎng)面積，反應(yīng)器所得病毒總量是轉(zhuǎn)瓶所得病毒總量的2.8～18.5倍；相同抗原含量的滅活苗，反應(yīng)器與轉(zhuǎn)瓶工藝產(chǎn)品無顯著性差異，血凝抑制效價均為1∶896。

4 結(jié) 語

本試驗確定了NBS生物反應(yīng)器培養(yǎng)F81細胞生產(chǎn)犬細小病毒YA-16-C66株的工藝，屬于該毒株在NBS生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的初步探索。利用該工藝培養(yǎng)的犬細小病毒YA-16-C66株，抗原滴度達到107.8TCID50/100μL，工藝產(chǎn)品血凝抑制效價HI在1∶768以上，完全達到犬細小滅活苗制備的要求[13]，且比轉(zhuǎn)瓶工藝抗原產(chǎn)量高，極大的節(jié)約了生產(chǎn)成本，為犬細小病毒YA-16-C66株的產(chǎn)業(yè)化提供了一種經(jīng)濟有效的方法。