周佳豪，雷文平，劉成國(guó),周輝,周杏榮,葉望娟

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙，410128)

隨著對(duì)乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)益生功能研究的深入，其受到了食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛關(guān)注；為了讓益生菌便于保存、運(yùn)輸及使用，對(duì)菌株的保護(hù)并制備成相應(yīng)菌劑也成為領(lǐng)域的研究重點(diǎn)[1]。菌株菌液的干燥工藝是制備益生菌菌劑的關(guān)鍵步驟之一，目前，主要的干燥方式包括真空干燥、真空冷凍干燥和噴霧干燥等，大量研究表明，真空冷凍干燥是目前在保護(hù)LAB活力最為有效且應(yīng)用最廣泛的干燥方式，其是快速將菌液溫度降低至冰點(diǎn)以下，變成固態(tài)，在高真空度和低溫狀態(tài)下固態(tài)菌液升華除水的一種干燥方式[2-3]。謝桂勉[4]比較了離心噴霧干燥和冷凍干燥對(duì)酸奶中LAB活性的影響，結(jié)果表明LAB的存活率分別為17.1%和53.5%，冷凍干燥對(duì)LAB的活力影響較小。并且WANG等[5]研究發(fā)現(xiàn)，與真空和熱風(fēng)干燥相比，真空冷凍干燥能夠顯著維持LAB發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性。

真空冷凍過程中LAB細(xì)胞內(nèi)容物易發(fā)生變性導(dǎo)致菌株死亡，這就需要加入適宜的保護(hù)劑降低菌株在此過程中的死亡[6]。目前，常用的保護(hù)劑包括糖類(海藻糖、低聚木糖等)、蛋白質(zhì)(脫脂乳粉、乳清蛋白等)以及其他聚合物(谷氨酸鈉、抗壞血酸)[7]。不同類型的保護(hù)劑的作用機(jī)制存在較大，如低聚糖可以進(jìn)入LAB細(xì)胞壁并被截留在細(xì)胞膜外而起保護(hù)作用；蛋白質(zhì)可以在菌體表面形成蛋白膜，使得菌株免受外界環(huán)境的破壞而發(fā)揮保護(hù)作用；抗氧化劑能夠降低菌株表面的氧化還原電位，減小益生菌的氧化損傷[8]。因此，復(fù)配使用不同類型保護(hù)劑可有效減小LAB在冷凍過程中的死亡。

本研究在高密度培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，通過單因素試驗(yàn)考察不同類型凍干保護(hù)劑(海藻糖、脫脂乳、低聚木糖和谷氨酸鈉)用量對(duì)LactobacilluscaseiLZ183E在冷凍過程中存活率的影響；進(jìn)一步通過響應(yīng)面法，對(duì)保護(hù)劑進(jìn)行復(fù)配研究，協(xié)調(diào)不同保護(hù)劑的性能而獲得較高活菌數(shù)的干酪乳桿菌菌劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L.caseiLZ183E，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院功能乳制品實(shí)驗(yàn)室；MRS肉湯、瓊脂，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；海藻糖、低聚木糖、谷氨酸鈉，上海瑞永生物科技有限公司；脫脂乳粉，皇氏集團(tuán)湖南優(yōu)氏乳業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2104型電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；GZ-400-S型恒溫培養(yǎng)箱，韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司；SW-CJ-2D型雙人單面垂直凈化工作臺(tái)，蘇州凈化有限公司；BKQ-B50II型全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋，山東博科科學(xué)儀器有限公司；TG16-WS型臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；LGJ-18C型臺(tái)式高速離心機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；MDF-86V408型醫(yī)用-80 ℃低溫保存箱，安徽中科都菱商用電器股份有限公司；Bante920型pH計(jì)，上海般特儀器制造有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 菌劑的制備

(1)菌株活化：將保存的LZ183E菌液在MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃過夜活化3代。

(2)高密度培養(yǎng)：把活化后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LZ183E以2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種于優(yōu)化后的MRS培養(yǎng)基中，37 ℃高密度培養(yǎng)30 h，獲得菌液備用。

(3)菌泥的制備：在無菌的條件下，取2 mL菌液于10 mL無菌離心管中，8 000 r/min、4 ℃離心3 min，然后用滅菌生理鹽水進(jìn)行2次清洗，得到菌泥，備用[9]。

(4)凍干：向含菌泥的10 mL離心管中加入2 mL已配制的凍干保護(hù)液，于-80 ℃冰箱中凍存6 h，然后迅速放入真空冷凍干燥機(jī)中干燥24 h以上，直至菌液凍干呈顯棉絮狀，得到凍干菌劑，此過程保持無菌[10]。

1.3.2 單一組分的凍干保護(hù)劑用量的確定

通過單因素試驗(yàn)考察海藻糖、脫脂乳粉、低聚木糖和谷氨酸鈉等保護(hù)劑的用量對(duì)LZ183E在冷凍過程中存活率的影響，其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下[11-13]：

按照1.3.1的方法制備凍干菌劑，其中控制真空冷凍干燥機(jī)條件不變，以菌株存活率和菌劑產(chǎn)酸能力為指標(biāo)，探究不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的海藻糖(2%、4%、6%、8%、10%)、低聚木糖(2%、4%、6%、8%和10%)、脫脂乳粉(2%、6%、10%、14%和18%)、谷氨酸鈉(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%)對(duì)菌株LZ183E在凍干以后活力的影響，確定其適宜的濃度范圍，并以未加保護(hù)劑為空白對(duì)照組(CK組)。

1.3.3 復(fù)配保護(hù)劑的響應(yīng)面法優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以菌株存活率為指標(biāo)，選取對(duì)菌株活性影響顯著的3個(gè)因素進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行復(fù)配優(yōu)化，確定保護(hù)劑的最佳配比。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 活菌數(shù)測(cè)定及存活率的計(jì)算

活菌數(shù)參照GB 4789.35—2016進(jìn)行測(cè)定。將凍干菌粉按原比例復(fù)溶進(jìn)行試驗(yàn)，凍干前后菌株存活率按公式(1)計(jì)算：

(1)

1.4.2 pH值的測(cè)定

將凍干后的菌劑以3%的接種量加入滅菌后的脫脂牛奶中，37 ℃發(fā)酵12 h后使用pH計(jì)直接測(cè)定發(fā)酵乳的pH值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及統(tǒng)計(jì)分析，以SPSS Statistics 21進(jìn)行方差分析(ANOVA)、LSD多重比較以及進(jìn)行正交試驗(yàn)方差分析，顯著水平P<0.05；采用Design-Expert V 10 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析；使用Origin 2018軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻糖用量對(duì)菌劑活力的影響

海藻糖能夠避免低溫和失水等極端環(huán)境對(duì)益生菌造成損傷，其使得液晶-凝膠態(tài)相變溫度降低，保持菌體細(xì)胞膜處于液晶狀態(tài)，減緩相變引起的細(xì)胞膜磷脂膜結(jié)構(gòu)和功能損傷[14]。由圖1可知，雖然海藻糖用量在2%～10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時(shí)對(duì)LZ183E在凍干過程的保護(hù)作用無顯著差異(P>0.05)，菌株存活率處于波動(dòng)狀態(tài)，但是凍干后菌株LZ183E仍然維持較高活力，其存活率在(93.479±1.667)%～(97.326±0.25)%，顯著高于CK組(P<0.05)。當(dāng)海藻糖用量在6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時(shí)，對(duì)菌株的保護(hù)效果最好，并且此時(shí)菌劑的產(chǎn)酸能力也對(duì)應(yīng)較強(qiáng)，發(fā)酵12 h后發(fā)酵乳的pH相對(duì)較低，為4.572±0.002；SKIBINSKY等[15]研究發(fā)現(xiàn)使用不同量的海藻糖，單層和雙層的模擬磷酸分子膜面積均發(fā)生擴(kuò)張，但僅是有或無海藻糖兩種情況的數(shù)據(jù)差異，不存在海藻糖用量依賴性，這也就證明不同用量的海藻糖對(duì)菌株存活率影響較小的現(xiàn)象。總體而言，海藻糖是一種較佳的保護(hù)劑，并且在6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的用量時(shí)對(duì)菌株的保護(hù)作用較好。

圖1 海藻糖用量對(duì)菌劑活力的影響Fig.1 Effect of the trehalose on the viability of LAB agents注:不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 低聚木糖用量對(duì)菌劑活力的影響

低聚木糖是應(yīng)用較為廣泛的功能性低聚糖，其可作為益菌因子在菌劑制備中發(fā)揮雙重作用，不僅能有效保護(hù)益生菌在冷凍過程中的活力，還能促進(jìn)益生菌的生長(zhǎng)代謝[16]。由圖2可知，隨著低聚木糖用量的增加，LZ183E在凍干后的存活率表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，在10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的添加量時(shí)具有最高存活率(96.081±0.395)%，明顯高于CK組；尤其當(dāng)用量從2%升至6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時(shí)，菌株存活率顯著升高(P<0.05)，而此后隨著用量進(jìn)一步增大，其存活率的增加或降低并不顯著(P>0.05)，表明低聚木糖在低濃度時(shí)其保護(hù)效果具有濃度差異性，而當(dāng)過高時(shí)已經(jīng)飽和對(duì)菌株的保護(hù)效果不明顯。此外，菌劑在產(chǎn)酸能力上，隨著低聚木糖用量的升高也表現(xiàn)出較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，發(fā)酵12 h后發(fā)酵乳pH可降低至4.5以下，這進(jìn)一步表明低聚木糖可作為益生因子而促進(jìn)LAB的生長(zhǎng)代謝。綜合可得，當(dāng)?shù)途勰咎翘砑恿繛?0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時(shí)有較好保護(hù)作用。

圖2 低聚木糖用量對(duì)菌劑活力的影響Fig.2 Effect of the xylooligosaccharides on the viability of LAB agents

2.3 脫脂乳粉用量對(duì)菌劑活力的影響

脫脂乳粉是一種復(fù)合保護(hù)劑，包含豐富的蛋白質(zhì)(乳清蛋白和酪蛋白)、糖類等物質(zhì)，不僅是益生菌優(yōu)良的天然培養(yǎng)基，且對(duì)在保護(hù)益生菌方面具有重要意義[17]。由圖3可知，脫脂乳粉的保護(hù)作用也存在用量依賴性，隨脫脂乳粉用量的增加，LZ183E的存活率緩慢上升，在10%～14%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))趨于穩(wěn)定，此時(shí)菌株存活率高于97%，而當(dāng)高于14%的用量時(shí)存活率急劇下降(P<0.05)，但仍然高于CK組；并且菌劑的產(chǎn)酸能力也表現(xiàn)出對(duì)應(yīng)關(guān)系，菌株存活率越高，產(chǎn)酸能力越強(qiáng)。這可能是由于脫脂乳粉是一種復(fù)合型保護(hù)劑，物質(zhì)組成較為復(fù)雜，凍干后其無定型的多孔結(jié)構(gòu)和蛋白保護(hù)膜，有效增強(qiáng)了菌株存活能力和菌劑的復(fù)水能力；然而脫脂乳粉用量過高，體系滲透壓升高，使得菌株細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞內(nèi)容物外泄和蛋白質(zhì)變性等，存活率顯著降低[18]。由此，選用10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的脫脂乳粉為最佳。

圖3 脫脂乳粉用量對(duì)菌劑活力的影響Fig.3 Effect of the skimmed milk powder on the viability of LAB agents

2.4 谷氨酸鈉用量對(duì)菌劑活力的影響

谷氨酸鈉屬于氨基酸類物質(zhì)，分子質(zhì)量小，可以透過益生菌細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，抑制并減緩冰晶的生成和生長(zhǎng)，從而避免冷凍給菌株造成的損傷[19]。由圖4可知，谷氨酸鈉用量在0.5%～1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時(shí)菌株保持著高于95%的存活率，當(dāng)用量大于1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時(shí)干菌株存活率顯著下降(P<0.05)，并且用量在2.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時(shí)存活率最低，為(85.758±0.949)%，已經(jīng)接近CK組，對(duì)菌株的保護(hù)作用表現(xiàn)出明顯不足。此時(shí)產(chǎn)酸能力也相對(duì)較弱，但對(duì)整體產(chǎn)酸能力影響不大。這可能是由于谷氨酸鈉能夠透過細(xì)胞膜進(jìn)入干酪乳桿菌細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)谷氨酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高，進(jìn)入胞內(nèi)的谷氨酸鈉含量也偏高，導(dǎo)致胞內(nèi)部分活性物質(zhì)失活，而當(dāng)菌株在低溫和失水狀態(tài)時(shí)難以較好地維持其生命活力，其存活率顯著降低。因此，選擇1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的谷氨酸鈉用量最為適宜。

圖4 谷氨酸鈉用量對(duì)菌劑活力的影響Fig.4 Effect of the sodium glutamate on the viability of LAB agents

2.5 復(fù)配保護(hù)劑的響應(yīng)面分析法優(yōu)化結(jié)果

通過分析單因素試驗(yàn)結(jié)果，控制海藻糖用量為6%，以L.caseiLZ183E存活率為指標(biāo)，進(jìn)一步對(duì)低聚木糖、脫脂乳粉以及谷氨酸鈉復(fù)配用量進(jìn)行優(yōu)化；其Box-Behnken 設(shè)計(jì)表及結(jié)果分別見表1和表2[20-21]。

表1 保護(hù)劑復(fù)配優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests for compounding of protective agents

表2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of Box-Behnken tests

軟件Design Expert V 10對(duì)試驗(yàn)結(jié)果擬合的回歸方程為Y=98.226 8+0.551 25X1-0.320 125X2-0.350 875X3-1.063X1X2-0.134 5X1X3-0.057 75X2X3-1.346 275X12-1.087 025X22-0.207 525X32。其方差分析結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface methodology results

由表3可知，本實(shí)驗(yàn)建立的模型極顯著(P<0.01)；失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，因此模型可靠性較高；并且R2=0.912 5，說明脫脂乳粉、低聚木糖和谷氨酸鈉對(duì)LZ183E存活率的影響顯著；信噪比(signal-to-noise，S/N)=8.728 4>4，也從另一角度說明所建立的模型是可靠的。經(jīng)方差分析，3個(gè)因素對(duì)凝固型發(fā)酵牛乳影響的主次順序?yàn)閄1>X3>X2，即脫脂乳粉用量>谷氨酸鈉用量>低聚木糖用量。

研究表明,響應(yīng)面的等高線越偏向橢圓，因素間交互作用越強(qiáng)；并且其呈現(xiàn)在閉合的橢圓或圓形，表明在試驗(yàn)范圍內(nèi)有最值[22-23]。試驗(yàn)所得響應(yīng)面曲線及等高線如圖5所示。當(dāng)谷氨酸鈉用量保持不變時(shí)，隨著脫脂乳粉和低聚木糖用量的升高，菌株存活率均表現(xiàn)為先升后降，脫脂乳粉用量在8.5%～13.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))和低聚木糖量在6%～10.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))較為適宜；等高線呈現(xiàn)閉合橢圓且響應(yīng)面為凸形，表明脫脂乳粉用量和低聚木糖用量交互作用顯著，并且此區(qū)間內(nèi)有最大值。當(dāng)?shù)途勰咎怯昧坎蛔儠r(shí)，隨著脫脂乳粉和谷氨酸鈉用量的增大，菌株存活率也表現(xiàn)出先增后降的趨勢(shì)，脫脂乳粉用量在8.7%～13.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))和谷氨酸鈉用量在0.3%～1.75%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))較佳；此范圍內(nèi)等高線為閉合橢圓且響應(yīng)面為凸形，說明脫脂乳粉用量和谷氨酸鈉用量交互作用有最大值。當(dāng)脫脂乳粉用量不變時(shí)，隨低聚木糖和谷氨酸鈉用量的增加，菌株存活率同樣表現(xiàn)為先增后降的趨勢(shì)，低聚木糖用量在7.1%～11.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，谷氨酸鈉用量在0.4%～18%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))較佳；此時(shí)等高線的形狀為閉合橢圓且響應(yīng)面為凸形，說明在此區(qū)間內(nèi)低聚木糖和谷氨酸鈉交互作用強(qiáng)，并具有最大值。此外，上述分析和表3中的顯著性一致。

a-X1、X2交互作用；b-X1、X3交互作用；c-X2、X3交互作用圖5 各因素交互作用的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface and contour of the interaction of various factors

3 結(jié)論

利用Design Expert 8.0.5軟件將結(jié)果帶入模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，確定保護(hù)劑的最佳復(fù)配參數(shù)為低聚木糖用量8.785 55%、脫脂乳粉用量11.484 2%和谷氨酸鈉用量1.038 34%(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))，此時(shí)菌株存活率預(yù)測(cè)值為98.539 7%。為了提高實(shí)際操作效率，并結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終將配方修訂為海藻糖用量6.0%、低聚木糖用量8.5%、脫脂乳粉用量11.5%和谷氨酸鈉用量1.0%(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))。在此最優(yōu)配比下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，菌株的存活率為(98.236±0.137)%，接近模型的預(yù)測(cè)值，表明了此模型的可靠性，獲得了較高活菌數(shù)下高存活率的L.caseiLZ183E菌劑。