孫曉紅，后來(lái)旺，李達(dá)容，趙勇，黃新新，何宇平，藍(lán)蔚青,3*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海, 201306)2(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，上海, 201306) 3(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海, 210306)4(上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，上海, 200135)

微生物污染是引起食物中毒和動(dòng)植物病疫的主因之一，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法主要通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)合生理生化鑒定，其檢測(cè)過(guò)程一般需要3～6 d，不但耗時(shí)耗力，且對(duì)技術(shù)條件要求較高，無(wú)法滿(mǎn)足政府與企業(yè)倡導(dǎo)的快速簡(jiǎn)便需求，開(kāi)發(fā)新型快速檢測(cè)技術(shù)成為當(dāng)務(wù)之急?？焖贆z測(cè)技術(shù)相對(duì)傳統(tǒng)培養(yǎng)法和依賴(lài)儀器檢測(cè)而言，其最大特點(diǎn)是簡(jiǎn)便快速，不依賴(lài)精密儀器的輔助，檢測(cè)時(shí)間短等。目前常用的快速檢測(cè)方法有化學(xué)比色法、酶抑制技術(shù)、分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)與生物芯片技術(shù)等。其中，分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)以其靈敏度高、漏檢率低、窗口期檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)在常規(guī)快速檢測(cè)技術(shù)中占明顯優(yōu)勢(shì)，其主要通過(guò)“核酸提取-擴(kuò)增-檢測(cè)”三步操作對(duì)核酸分子的精確鑒定，從而提供各類(lèi)風(fēng)險(xiǎn)源以及疫病檢出的相關(guān)信息，為其預(yù)防、監(jiān)控和治療提供有效依據(jù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)自20世紀(jì)80年代引入以來(lái)，已作為分子生物學(xué)研究的重要手段，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域中[1-2]。然而，由于PCR技術(shù)及其衍生技術(shù)均存在對(duì)溫控設(shè)備的依賴(lài)性高、熱循環(huán)過(guò)程耗時(shí)與操作專(zhuān)業(yè)化等特點(diǎn)，其應(yīng)用范圍受限；而與之相比，重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)只需溫度調(diào)控，無(wú)需特殊儀器輔助，易于實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一種新型的體外核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其擴(kuò)增原理是各種酶在腺嘌呤核苷三磷酸(adenosione triphosphate，ATP)作用下，重組酶蛋白與寡核苷酸引物結(jié)合形成重組絲復(fù)合物，單鏈DNA結(jié)合蛋白通過(guò)鏈置換方式，將模板DNA解鏈，自身與單鏈DNA模板結(jié)合，防止在形成新鏈DNA之前母鏈聚集配對(duì)；隨后，重組絲復(fù)合物掃描模板DNA單鏈，當(dāng)識(shí)別到與之引物相互配對(duì)的序列時(shí)，負(fù)責(zé)堿基配對(duì)的重組酶蛋白可通過(guò)與單鏈DNA結(jié)合蛋白結(jié)合，阻截細(xì)胞核內(nèi)核酸酶降解單鏈DNA[3]；最后，DNA聚合酶在引物的3′端添加堿基進(jìn)行DNA復(fù)制延伸。重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)反應(yīng)機(jī)制如圖1所示。

圖1 重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)反應(yīng)機(jī)制Fig.1 Reaction mechanism of isothermal recombinase amplification

目前，重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)包括RPA(recombinase polymerase amplification)和RAA(recombinase aided amplification)2種技術(shù)[4-5]，其不同之處在于RAA是細(xì)菌或真菌中獲得的重組酶來(lái)替代RPA技術(shù)中較難獲得的噬菌體重組酶，兩者整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程一致，通過(guò)結(jié)合、鏈置換、延伸實(shí)現(xiàn)體外DNA擴(kuò)增?，F(xiàn)有研究表明，RPA與RAA技術(shù)能在恒定或較寬溫度范圍內(nèi)，通過(guò)30 min左右自動(dòng)循環(huán)的動(dòng)態(tài)環(huán)境，可實(shí)現(xiàn)微量核酸在體外高效快速擴(kuò)增，再由端點(diǎn)檢測(cè)法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，即可得到理想檢測(cè)結(jié)果[6]。近年來(lái)，隨著研究人員對(duì)分析檢測(cè)效率與準(zhǔn)確度要求的逐年提升，RPA與RAA技術(shù)在分析檢測(cè)領(lǐng)域中得到較廣泛的應(yīng)用。本文在簡(jiǎn)述RPA與RAA技術(shù)擴(kuò)增原理的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)闡述了重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在病毒與細(xì)菌檢測(cè)、動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫、食品安全等方面的應(yīng)用研究進(jìn)展，提出存在問(wèn)題與解決辦法，展望了其未來(lái)發(fā)展前景，以期為后期RPA與RAA技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域的拓展提供理論參考。

1 重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在分析檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

RPA技術(shù)發(fā)展至今已有10余年，其應(yīng)用領(lǐng)域比RAA技術(shù)廣泛，尤其在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方面中發(fā)揮著重要的作用。RAA作為一種新型的具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，其重組酶來(lái)源廣泛，使等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)得以豐富，更充實(shí)了體外核酸擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展。2項(xiàng)技術(shù)在病毒與細(xì)菌檢測(cè)、動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫與食品安全等領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。

1.1 病毒檢測(cè)

手足口病是嚴(yán)重公共衛(wèi)生問(wèn)題引起的主要傳染病，主要特征表現(xiàn)為口腔黏膜皰疹或潰瘍和手、足部出疹等，其主要由20多種腸道病毒引起，以柯薩奇病毒CA16型和腸道病毒EV71型最常見(jiàn)，也有柯薩奇病毒CA6型和CA10型引起的癥狀[7]。采用RPA與RAA技術(shù)可實(shí)現(xiàn)該病毒的快速準(zhǔn)確檢測(cè)。其中，YIN等[8]使用實(shí)時(shí)Real-time-RPA(RT-RPA)技術(shù)檢測(cè)EV71，在臨床樣品評(píng)估中得出該檢測(cè)技術(shù)與RT-qPCR差異不大，但檢測(cè)精度明顯提高，且時(shí)間短；LI等[9]通過(guò)RT-RAA技術(shù)可在42 ℃條件下，30 min高靈敏檢測(cè)到EV71與CA16，臨床診斷特異性高；WANG等[10]建立了RT-RPA技術(shù)快速檢測(cè)柯薩奇病毒CA-A6的方法；YAN等[11]建立RT-RAA技術(shù)檢測(cè)柯薩奇病毒CA-A6和CA-A10，檢測(cè)結(jié)果與RT-qPCR一致，特異性高達(dá)100%，在監(jiān)測(cè)感染與疫情控制中均具潛在價(jià)值。在其他病毒檢測(cè)方面，SHEN等[12]通過(guò)熱處理粗提基因組DNA，用RT-RAA法30 min內(nèi)可檢測(cè)到乙型肝炎病毒，該病毒與人類(lèi)免疫缺陷病毒和丙型肝炎病毒無(wú)交叉反應(yīng)；BAI等[13]通過(guò)熱處理粗提基因組DNA，建立了RT-RAA法結(jié)合內(nèi)部控制對(duì)照及RAA技術(shù)與側(cè)流層析試紙條(lateral-flow dipstick, LFD)雙重檢測(cè)，能有效消除假陽(yáng)性結(jié)果；此外，呼吸道合胞病毒是一種能在全球范圍內(nèi)引起嬰幼兒下呼吸道感染的病原體，有學(xué)者通過(guò)RT-RAA技術(shù)[14]和RT-RPA技術(shù)[15]提高靈敏度快速檢測(cè)到呼吸道合胞病毒，表現(xiàn)出很大的檢測(cè)應(yīng)用潛力。

1.2 細(xì)菌檢測(cè)

由于傳統(tǒng)檢測(cè)方法存在費(fèi)時(shí)、檢測(cè)精度不高等缺點(diǎn)，對(duì)細(xì)菌污染引起的傷口感染、食物污染、因動(dòng)物攜帶造成的交叉感染等得不到及時(shí)控制，檢測(cè)部門(mén)對(duì)快速檢測(cè)技術(shù)的需求日益增多。RPA技術(shù)起初由PIEPENBURG等[3]提出，將其用于檢測(cè)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的特異基因，可檢測(cè)到低至10個(gè)拷貝模板；目前，RPA與RAA技術(shù)已廣泛應(yīng)用于副溶血性弧菌、大腸桿菌與金黃色葡萄球菌等檢測(cè)中。其中，孫曉紅等[16]建立了RAA-LFD技術(shù)檢測(cè)副溶血性弧菌的方法，并對(duì)檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化，獲得反應(yīng)溫度為37 ℃，擴(kuò)增時(shí)間為20 min的最佳反應(yīng)條件。該方法檢測(cè)靈敏度比常規(guī)PCR高10倍數(shù)量級(jí)，為現(xiàn)場(chǎng)或低資源環(huán)境中檢測(cè)副溶血性弧菌提供了一種簡(jiǎn)便、快速、特異靈敏的方法；魏瑩等[17]對(duì)易引起人和動(dòng)物感染性疾病的病原體A族乙型溶血性鏈球菌通過(guò)RAA技術(shù)在恒定溫度下，20 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)；DU等[18]將RPA技術(shù)在37～42 ℃擴(kuò)增單核細(xì)胞增生李斯特菌目的基因，擴(kuò)增產(chǎn)物可直接用LFD肉眼觀察；周廣彪等[19]建立基于RPA的檢測(cè)方法特異性好，不需要任何儀器輔助，只在人體溫度的條件下特異性擴(kuò)增就可得到擬態(tài)弧菌的特異性目的條帶，其靈敏度與常規(guī)PCR法一致。

1.3 動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫

血吸蟲(chóng)病是一種能引起人和動(dòng)物共感染的寄生蟲(chóng)病，衛(wèi)生部報(bào)告顯示，近年來(lái)國(guó)家在控制血吸蟲(chóng)病方面進(jìn)展緩慢[20]，原因在于缺乏有效的診斷方法來(lái)監(jiān)測(cè)低強(qiáng)度感染與評(píng)估干預(yù)效果。因此，開(kāi)發(fā)有效的快速檢測(cè)手段勢(shì)在必行[21-22]。SONG等[23]建立了RAA檢測(cè)日本血吸蟲(chóng)特異性基因片段的新方法，可在30 min內(nèi)簡(jiǎn)便快速檢測(cè)到最低檢測(cè)模板為20拷貝或0.5 ng基因組DNA；SUN等[24]通過(guò)RPA-LFD技術(shù)快速直觀檢測(cè)到日本血吸蟲(chóng)，為評(píng)價(jià)其有效性，與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和間接血凝試驗(yàn)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)RPA-LFD技術(shù)的靈敏性和特異性均高于另外2種，在現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用中潛力良好；唐慧驥等[25]通過(guò)建立的RAA方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)新菠蘿灰粉蚧帶來(lái)的危害，具有耗時(shí)短，特異性區(qū)分效果好，適于檢驗(yàn)人員快速檢測(cè)篩查；周鴻讓等[26-27]根據(jù)多房棘球絳蟲(chóng)線粒體基因序列設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行RAA擴(kuò)增后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis,AGE)檢測(cè)，能快速高效區(qū)分多房棘球絳蟲(chóng)與其他寄生蟲(chóng)，并通過(guò)建立雙重RAA方法成功檢測(cè)多房棘球絳蟲(chóng)的2種類(lèi)型，為多房棘球絳蟲(chóng)蟲(chóng)種鑒定與棘球蚴病基因診斷提供有效的技術(shù)支撐。

1.4 食品安全

食品安全一直是消費(fèi)者關(guān)注的焦點(diǎn)。2013年歐洲爆發(fā)的“馬肉風(fēng)波”[28]，用豬肉制作假牛肉干和牛肉丸子[29]行為欺騙消費(fèi)者，擾亂市場(chǎng)。早期有基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)和等溫?cái)U(kuò)增熒光(isothermal amplification fluorescent technology, IAFT)技術(shù)應(yīng)用到動(dòng)物源性摻假檢測(cè)中，但其所需引物復(fù)雜、操作繁瑣[30-32]。部分研究者將RPA技術(shù)應(yīng)用于肉類(lèi)和轉(zhuǎn)基因等方面檢測(cè)，在實(shí)際檢測(cè)中獲得了良好的效果。如郭燕華等[33]以牛源性線粒體細(xì)胞色素b基因建立了特異性RPA檢測(cè)方法，其靈敏度可達(dá)0.1 ng/μL，可用于市售生鮮肉制品及加工肉制品中牛源性成分鑒定；林霖等[34]基于細(xì)胞色素C氧化酶亞型I中的豬特異性DNA序列結(jié)合核酸快速提取方法，建立RT-RPA快速檢測(cè)法，可檢出低至1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的豬肉含量，對(duì)牛肉中是否摻有豬肉成分達(dá)到較好的區(qū)分。

商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因作物會(huì)讓一些利益分子乘虛而入，將用作飼料和其他用途的轉(zhuǎn)基因作物摻入到消費(fèi)者的食品中。因此，有必要在轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物檢測(cè)領(lǐng)域開(kāi)發(fā)快速高效、易于攜帶的檢測(cè)裝備。其中，劉靜等[35]根據(jù)外源基因草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因與載體骨架連接區(qū)序列設(shè)計(jì)引物建立RPA檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米Bt11的方法，檢測(cè)限遠(yuǎn)低于歐盟國(guó)家設(shè)定的轉(zhuǎn)基因最低限量0.9%，靈敏度高，可滿(mǎn)足相關(guān)行業(yè)的日常檢測(cè)需求；謝實(shí)龍[36]建立RT-RPA快速篩查體系，能高靈敏度地檢出最低48拷貝數(shù)的模板。該技術(shù)在實(shí)際樣品篩查中,能提供穩(wěn)定可靠結(jié)果，在轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

2 存在問(wèn)題與解決辦法

重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)具有不受場(chǎng)地限制與檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，是一種理想可推廣的快速檢測(cè)方法。RPA與RAA技術(shù)作為新型重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，仍存在部分缺點(diǎn)。如重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)分析易受多種因素影響。內(nèi)因主要包括酶活性、引物探針設(shè)計(jì)等，外因主要包括產(chǎn)物檢測(cè)前處理、反應(yīng)溫度和假陰性問(wèn)題等。此外，固定反應(yīng)體系和較高試劑成本也影響其普適性。

2.1 酶促反應(yīng)

重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)主要借助重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白與DNA聚合酶等3種核心酶的協(xié)同作用完成擴(kuò)增反應(yīng)，其對(duì)蛋白酶活性要求較高，一方面需要保證反應(yīng)體系中酶活性，任何一種酶失活都會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增失敗；另一方面需要保證反應(yīng)體系中各種酶接觸充分，有效反應(yīng)才能促進(jìn)產(chǎn)物形成，提高反應(yīng)效率。反應(yīng)后的產(chǎn)物檢測(cè)方法多樣，主要有AGE[29，37]、RT-RAA和RT-RPA[38-39]、LFD[40]與聯(lián)動(dòng)CRISPR/Cas系統(tǒng)[41]等。但反應(yīng)結(jié)束后的體系中存在大量蛋白酶，若在進(jìn)行AGE前不做處理，電泳結(jié)束后成像觀察有抹帶現(xiàn)象，影響目的條帶觀察。因此，重組酶等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物在進(jìn)行AGE前需要通過(guò)高溫使蛋白變性失活，離心取上清液進(jìn)行檢測(cè)[42]；同時(shí)，通過(guò)加入酚-氯仿-異戊醇進(jìn)行純化處理，檢測(cè)其上清液[43]。

2.2 引物探針設(shè)計(jì)

一個(gè)良好的核酸擴(kuò)增關(guān)鍵在于引物與探針設(shè)計(jì)，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)引物長(zhǎng)度應(yīng)在30 bp左右，過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短均會(huì)影響擴(kuò)增速度和檢測(cè)靈敏度；擴(kuò)增片段應(yīng)在80～500 bp，以保證擴(kuò)增反應(yīng)的快速靈敏且有效。若樣品需要定時(shí)定量，可在該反應(yīng)體系中添加探針，探針位置應(yīng)位于上下游引物中間，設(shè)計(jì)時(shí)盡量避免下游引物和探針的重疊，減少影響擴(kuò)增效率與產(chǎn)生非特異性信號(hào)的二聚體形成。最新開(kāi)發(fā)的一款基于Python的軟件包[44]能自動(dòng)創(chuàng)建和過(guò)濾RPA引物和探針對(duì)，其對(duì)比幾個(gè)序列識(shí)別保守目標(biāo)，并過(guò)濾與可能背景生物交叉反應(yīng)區(qū)域。但其使用需要一定的程序編輯基礎(chǔ)，這無(wú)疑給工作人員在篩選優(yōu)化引物序列時(shí)增加技術(shù)難度，降低效率。因此，特異性引物設(shè)計(jì)需自行摸索，篩選合適引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增。其中，MOHAMMAD等[45]針對(duì)園藝作物設(shè)計(jì)了18對(duì)長(zhǎng)度為18～28 bp的引物，發(fā)現(xiàn)有4對(duì)引物能成功擴(kuò)增7種園藝作物的DNA。因此，有必要加強(qiáng)引物選擇，開(kāi)發(fā)能替代手動(dòng)設(shè)計(jì)的軟件來(lái)篩選最佳核苷酸引物對(duì)與探針。

2.3 反應(yīng)溫度

重組酶等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)可在較寬的溫度范圍內(nèi)高效完成(<40 min)。RAA與RPA技術(shù)主要借助酶的活性來(lái)完成擴(kuò)增，選擇最佳溫度是快速得到擴(kuò)增產(chǎn)物的前提。相關(guān)研究顯示[8,19,46]，RPA與RAA技術(shù)反應(yīng)溫度接近人體溫度，不依賴(lài)溫控設(shè)備，其在未來(lái)將會(huì)成為一種行之有效的自測(cè)手段，快速檢測(cè)人體自身的一些樣本。

2.4 假陰性問(wèn)題

核酸材料被污染是影響分析結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵，采取有效措施加以預(yù)防、避免至關(guān)重要。因此，擴(kuò)增前后的區(qū)域應(yīng)分開(kāi)、使用帶濾芯的槍頭、使用完的材料應(yīng)收集到密閉容器與在通風(fēng)櫥進(jìn)行操作均能提高檢測(cè)準(zhǔn)確度。擴(kuò)增得到的產(chǎn)物若要進(jìn)行AGE或LFD等的開(kāi)蓋檢測(cè)，勢(shì)必會(huì)引起氣溶膠污染，影響檢測(cè)結(jié)果，給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)一定誤差。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中進(jìn)行高溫或酚/氯仿純化處理，仍會(huì)帶來(lái)一定影響。對(duì)此可將核酸擴(kuò)增試劑管與檢測(cè)試劑管組裝，在一個(gè)密封的環(huán)境中完成檢測(cè)，避免了開(kāi)蓋操作引起的氣溶膠污染問(wèn)題，能提高現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)的準(zhǔn)確性[47]。

抑制劑或食品基質(zhì)的影響會(huì)使檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陰性，影響結(jié)果判斷，從而進(jìn)一步限制該技術(shù)在現(xiàn)場(chǎng)中的應(yīng)用。根據(jù)檢測(cè)對(duì)象添加一段看家基因序列作為擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)(internal amplification control，IAC)，與目標(biāo)基因同步擴(kuò)增。若檢測(cè)結(jié)果只有IAC條帶沒(méi)有目標(biāo)基因條帶，可判定為陰性，若檢測(cè)結(jié)果都沒(méi)有IAC條帶和目標(biāo)基因條帶，可判定反應(yīng)受到干擾或污染，出現(xiàn)假陰性，需重新進(jìn)行檢測(cè)，從而降低假陰性風(fēng)險(xiǎn)，提高檢測(cè)準(zhǔn)確度[48-49]。

2.5 使用成本

目前，市售的RAA和RPA技術(shù)都使用試劑盒，其反應(yīng)體系已固定，會(huì)使用戶(hù)使用靈活性明顯降低，體系更改必然會(huì)引起污染問(wèn)題，影響其普適性；作為具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)的技術(shù)，成本相對(duì)較高等問(wèn)題需要進(jìn)一步完善，通過(guò)研發(fā)出低廉、高效的酶制劑降低成本是行之有效的手段。

3 前景與展望

重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)作為在恒定溫度條件下反應(yīng)的新型核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，其具有凍干粉形式易于運(yùn)輸、靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)時(shí)間快、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，逐漸被人們認(rèn)可為一種“可替代PCR的技術(shù)”。雖然RAA與RPA技術(shù)還存在一定局限性，但這種重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)填補(bǔ)了傳統(tǒng)培養(yǎng)和依賴(lài)溫變?cè)O(shè)備技術(shù)外的空缺，這種新技術(shù)能在現(xiàn)場(chǎng)和非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境實(shí)現(xiàn)即時(shí)檢測(cè)，具有潛在優(yōu)勢(shì)。相比較RPA來(lái)說(shuō)，RAA重組酶來(lái)源相對(duì)廣泛，且是我國(guó)自主研發(fā)的新型等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，符合我國(guó)快速檢測(cè)的需求。相信在不久的將來(lái)，研究人員將能在了解和完善反應(yīng)機(jī)制的同時(shí)，使RAA與RPA擴(kuò)增技術(shù)在研究和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中發(fā)揮更大價(jià)值，實(shí)現(xiàn)“核酸提取-擴(kuò)增-檢測(cè)”三步一體化的操作。未來(lái)重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的發(fā)展方向和研究熱點(diǎn)將在小型化、便攜式儀器的基礎(chǔ)上，會(huì)在數(shù)字RPA、數(shù)字RAA和多通道檢測(cè)方面實(shí)現(xiàn)新的突破，將在低資源環(huán)境、部分醫(yī)療點(diǎn)和需求點(diǎn)等疾病突發(fā)地得到廣泛的推廣應(yīng)用。