李清清，余旭亞，耿樹香，馬婷，寧德魯，韓本勇

1(昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明，650500)2(云南省林業(yè)和草原科學(xué)院，云南 昆明，650204)

核桃在我國(guó)資源豐富，品種繁多。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2016年我國(guó)核桃種植面積723×104hm2，產(chǎn)量達(dá)365萬(wàn)t(干果)，種植面積和產(chǎn)量均居世界首位[1]。作為一種重要的木本油料植物資源，核桃仁中的油脂含量高達(dá)60%～70%[2]。核桃油含有豐富的脂肪酸和天然生物活性成分，具有保健益智的作用，并可預(yù)防癌癥和降低患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[3]。因此作為一種重要的功能性植物油脂，核桃油受到國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者的廣泛關(guān)注[4]。然而高含量的多不飽和脂肪酸極易導(dǎo)致核桃油氧化酸敗，影響其風(fēng)味、品質(zhì)及貨架期[5]。所以核桃油在保存過(guò)程中的氧化與抗氧化是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。

自由基具有極強(qiáng)的氧化作用，會(huì)氧化蛋白質(zhì)、損害核酸和破壞細(xì)胞膜上的多糖結(jié)構(gòu)，危害細(xì)胞和生物體，并誘發(fā)癌癥、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化和心腦血管疾病等[6]。植物油中有很多能夠消除自由基的抗氧化類功能因子，如黃佳聰?shù)萚7]證明騰沖紅花油茶籽油中的多酚類物質(zhì)具有較強(qiáng)的自由基清除能力。油脂中的抗氧化成分對(duì)維持油脂體系的穩(wěn)定具有重要意義，并對(duì)調(diào)節(jié)人體自由基代謝平衡、延緩衰老、預(yù)防心血管疾病和抗癌等有重要作用[8]。從膳食中攝取抗氧化成分，是預(yù)防疾病的最佳途徑，而通過(guò)食用油脂補(bǔ)充抗氧化物質(zhì)是一條理想途徑[9]。

將核桃油與其他食用油進(jìn)行調(diào)和可以提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[10]。美藤果油富含VE、多酚等天然抗氧化劑，具有比核桃油更強(qiáng)的氧化穩(wěn)定性[11]。李清清等[12]證明添加20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))美藤果油能夠顯著提高核桃油的氧化穩(wěn)定性和品質(zhì)。目前尚無(wú)對(duì)復(fù)合核桃油(添加20%美藤果油的核桃油)體外抗氧化活性研究的報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃油,購(gòu)自迪慶香格里拉舒達(dá)有機(jī)食品有限公司；美藤果油,購(gòu)自西雙版納印奇生物資源開發(fā)有限公司。

FeCl3、無(wú)水乙醇、NaH2PO4、Na2HPO4、NaOH、FeSO4、三氯乙酸、30%H2O2等、H2O230%、水楊酸，分析純，購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；HCl(分析純)，購(gòu)于重慶川東化工有限公司；菲啰嗪一鈉鹽、DPPH自由基，購(gòu)于上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；鄰苯三酚，購(gòu)于上海賢鼎生物科技有限公司；FeCl2、TBHQ，購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9053A真空干燥箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FA2004 N分析天平，上海箐海儀器有限公司；Ultrospec 2100pro紫外可見分光光度計(jì)，Amersham Biosciences；5804R離心機(jī)，Eppendorf；DS.85 10DTH超聲波微波組合體系，上海生析超聲儀器有限公司；HHw—D6水浴鍋，金壇雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定[13]

采用減量法準(zhǔn)確稱取1.0 g TBHQ、復(fù)合核桃油和核桃油，用無(wú)水乙醇定容至100 mL，配制成10 mg/mL的母液備用，現(xiàn)配現(xiàn)用，下同。

用無(wú)水乙醇將TBHQ(陽(yáng)性對(duì)照)、復(fù)合核桃油和核桃油母液(10 mg/mL)稀釋成質(zhì)量濃度分別為1、2、3、4、5、6 mg/mL的樣品備用。參照參考文獻(xiàn)[13]測(cè)定樣品的DPPH自由基清除能力，計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：A1為2 mL樣品溶液+2 mL DPPH溶液的吸光度；A2為2 mL樣品溶液+2 mL無(wú)水乙醇的吸光度；A3為2 mL無(wú)水乙醇+2 mL DPPH 溶液的吸光度。

1.3.2 羥自由基清除能力

用無(wú)水乙醇將TBHQ(陽(yáng)性對(duì)照)、復(fù)合核桃油和核桃油母液(10 mg/mL)稀釋成質(zhì)量濃度分別為1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mg/mL的樣品備用。參照參考文獻(xiàn)[14]測(cè)定樣品的羥自由基清除能力，計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：A1為2 mL樣品溶液+2 mL FeSO4溶液+2 mL H2O2溶液+2 mL水楊酸乙醇溶液的吸光度；A2為2 mL樣品溶液+2 mL FeSO4溶液+2 mL H2O2溶液+2 mL 蒸餾水的吸光度；A3為2 mL蒸餾水+2 mL FeSO4溶液+2 mL H2O2溶液+2 mL水楊酸乙醇溶液的吸光度。

1.3.3 超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定

用無(wú)水乙醇將TBHQ(陽(yáng)性對(duì)照)、復(fù)合核桃油和核桃油母液(10 mg/mL)稀釋成質(zhì)量濃度分別為 1、2、3、4、5、6、7 mg/mL的樣品備用。參照參考文獻(xiàn)[15]測(cè)定樣品的超氧陰離子自由基清除能力，計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

式中：A0為1 mL蒸餾水+4.5 mL 50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.2)緩沖液+0.4 mL 25 mmol/L鄰苯三酚溶液+1 mL 8 mmol/L HCl的吸光度；A1為1 mL樣品溶液+4.5 mL 50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.2)緩沖液+0.4 mL 25 mmol/L鄰苯三酚溶液+1 mL 8 mmol/L HCl的吸光度。

1.3.4 還原能力測(cè)定

采用鐵氰化鉀法測(cè)定。用無(wú)水乙醇將TBHQ(陽(yáng)性對(duì)照)、復(fù)合核桃油和核桃油母液(10 mg/mL)稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL的樣品備用。參照參考文獻(xiàn)[15]測(cè)定樣品的還原能力。

1.3.5 Fe2+鰲合能力測(cè)定[13]

用無(wú)水乙醇將TBHQ(陽(yáng)性對(duì)照)、復(fù)合核桃油和核桃油母液(10 mg/mL)稀釋成質(zhì)量濃度分別為 1、2、3、4、5、6、7 mg/mL的樣品備用。參照參考文獻(xiàn)[13]測(cè)定樣品的Fe2+鰲合能力，計(jì)算如公式(4)所示：

(4)

式中:A1為1 mL樣品溶液+3.7 mL蒸餾水+0.1 mL FeCl2溶液+0.2 mL菲啰嗪溶液；A2為1 mL樣品溶液+3.7 mL蒸餾水+0.1 mL 蒸餾水+0.2 mL菲啰嗪溶液；A2為1 mL蒸餾水+3.7 mL蒸餾水+0.1 mL FeCl2溶液+0.2 mL菲啰嗪溶液。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組平行，使用ANOVA(SPSS 19.0)一步法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。最小顯著性差異進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)調(diào)查不同試驗(yàn)的組間差異，圖中“*”表示同一時(shí)間與其他組差異顯著(P<0.05)；“**”表示同一時(shí)間與其他組差異極顯著(P<0.01)。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合核桃油對(duì)DPPH自由基清除能力

DPPH自由基是十分穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，其乙醇溶液呈紫色，在波長(zhǎng)517 nm處有強(qiáng)吸收。在抗氧化劑存在時(shí)，DPPH溶液顏色變淺，其在最大吸收波長(zhǎng)517 nm處的吸光度減小，吸光度的下降程度越高，樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力越強(qiáng)[16]。該法快速穩(wěn)定，已被廣泛用于油品抗氧化能力的評(píng)價(jià)復(fù)合核桃油對(duì)DPPH自由基清除能力的影響如圖1所示。

圖1 復(fù)合核桃油對(duì)DPPH自由基清除能力Fig.1 DPPH radical scavenging ability of blend walnut oil

由圖1可看出，純核桃油、復(fù)合核桃油(核桃油+20%美藤果油)和TBHQ對(duì)DPPH自由基均有清除作用，且隨著質(zhì)量濃度的增加，純核桃油和復(fù)合核桃油對(duì)DPPH自由基的清除率也在增加。TBHQ組的DPPH自由基的清除能力最強(qiáng)，其清除率穩(wěn)定在92%左右。在1.0～6.0 mg/mL時(shí)，復(fù)合核桃油的DPPH自由基最大清除率為(59.86±3)%，顯著高于純核桃油最大清除率[(34.19±2.54)%]，低于TBHQ[(92.33±2.06)%]。半抑制濃度IC50為自由基清除率為50%時(shí)所需抗氧化物質(zhì)的質(zhì)量濃度，IC50越小，表示其清除自由基的能力越強(qiáng)，抗氧化能力越強(qiáng)。復(fù)合核桃油對(duì)DPPH自由基清除率的IC50為2.72 mg/mL，極顯著低于純核桃油的IC50(62.21 mg/mL)。吳俏槿等[17]研究中美藤果油對(duì)DPPH自由基清除率的IC50為1.15 mg/mL，顯著低于橄欖油、茶油、亞麻籽油和紫蘇油，證明美藤果油具有較強(qiáng)的抗氧化能力。有研究表明幾種堅(jiān)果植物油的DPPH自由基清除能力與其含有的多酚、生育酚和甾醇含量相關(guān)，其中與生育酚的相關(guān)性最高[18]。趙貴興[19]研究表明添加適量大豆天然生育酚可提高食用油的抗氧化能力。筆者之前研究表明添加20%美藤果油后，核桃油中的生育酚含量有所提高[12]。

因此，添加20%美藤果油后，核桃油中生育酚含量的增加，可能致使其對(duì)DPPH自由基清除率顯著提高。

2.2 復(fù)合核桃油對(duì)羥自由基清除能力

作為活性氧的一類，羥自由基是機(jī)體內(nèi)反應(yīng)性和破壞性極強(qiáng)的自由基，與活細(xì)胞許多成分反應(yīng)，直接損傷各種生物大分子和生物膜，引發(fā)各種疾病和加快機(jī)體衰老，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生危害[20]。復(fù)合核桃油對(duì)羥自由基清除能力的影響如圖2所示。

圖2 復(fù)合核桃油對(duì)羥自由基清除能力Fig.2 Hydroxyl radical scavenging ability of blend walnut oil

由圖2可看出，相比純核桃油，復(fù)合核桃油對(duì)羥自由基具有較強(qiáng)的清除功能，且隨著質(zhì)量濃度的增加，其羥自由基清除率逐漸升高。在1.0～2.0 mg/mL 時(shí)，復(fù)合核桃油的羥自由基最大清除率為(85.86±1.54)%，顯著高于純核桃油最大清除率[(58.99±1.67)%]，低于TBHQ[(96.92±2.3)%]。復(fù)合核桃油、核桃油和TBHQ的羥自由基清除能力IC50分別為0.8、1.5和0.5 mg/mL，可見復(fù)合核桃油的羥自由基清除能力略低于TBHQ，顯著高于純核桃油。植物油中的多酚物質(zhì)與其氧自由基吸收能力呈正相關(guān)，對(duì)羥自由基有很強(qiáng)的清除能力[18]。這一結(jié)論在油茶籽毛油和橄欖油的研究中均被證實(shí)[21-22]。筆者之前的研究中，添加20%美藤果油后，核桃油中的多酚含量亦有顯著性增加[12]。

因此，復(fù)合核桃油具有比純核桃油更高的羥自由基清除率的原因可能是，20%美藤果油的添加提高了核桃油的多酚含量。

2.3 復(fù)合核桃油對(duì)超氧陰離子自由基清除能力

超氧陰離子自由基總量在機(jī)體內(nèi)較少時(shí)，可有效殺傷侵入機(jī)體的有害菌，對(duì)機(jī)體有益；但其含量過(guò)多時(shí)，會(huì)破壞健康細(xì)胞，加快機(jī)體衰老，導(dǎo)致多種疾病發(fā)生[15]。超氧陰離子自由基是所有活性氧自由基中的第一個(gè)自由基，經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)可產(chǎn)生其他氧自由基，是評(píng)價(jià)物質(zhì)抗氧化能力的重要指標(biāo)之一[23]。

如圖3所示，復(fù)合核桃油、核桃油和TBHQ的超氧陰離子自由基清除率在低質(zhì)量濃度范圍(1～2 mg/mL)增長(zhǎng)明顯，且在3 mg/mL后就穩(wěn)定在75%以上，在1.0～7.0 mg/mL范圍內(nèi)，復(fù)合核桃油的超氧陰離子自由基最大清除率(89.77±1)%與TBHQ(91.35±2.06)%相當(dāng)。復(fù)合核桃油、核桃油和TBHQ的超氧陰離子自由基清除能力IC50分別為0.9、1.7和0.4 mg/mL，可見復(fù)合核桃油的超氧陰離子自由基清除能力較差于TBHQ，大大強(qiáng)于核桃油。發(fā)芽糙米和牛油果等植物甾醇能夠清除超氧陰離子自由基，原因可能為植物甾醇側(cè)鏈的烯基參與了自由基清除反應(yīng)，導(dǎo)致其具有超氧陰離子自由基清除能力[24-25]。在菜籽研究中，其多酚類物質(zhì)對(duì)超氧陰離子自由基亦具有清除作用[26]。

因此，導(dǎo)致復(fù)合核桃油具有比核桃油更高的超氧陰離子自由基清除率的原因可能是，添加20%美藤果油后，核桃油中的甾醇和多酚含量增加，二者分別或協(xié)同對(duì)超氧陰離子自由基清除做出了貢獻(xiàn)。

圖3 復(fù)合核桃油對(duì)超氧陰離子自由基清除能力Fig.3 Superoxide anion scavenging ability of blend walnut oil

2.4 復(fù)合核桃油的還原能力

抗氧化劑利用自身還原能力給出電子，以達(dá)到清除自由基的作用，其還原能力與抗氧化活性存在一定的聯(lián)系，還原能力越強(qiáng)，抗氧化活性越強(qiáng)[15]。因此，可通過(guò)測(cè)定油品的還原能力來(lái)表征其抗氧化活性的強(qiáng)弱。

圖4 復(fù)合核桃油的還原能力Fig.4 The reduction capacity of blend walnut oil

由圖4可看出，純核桃油、復(fù)合核桃油和TBHQ對(duì)的還原能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的線性增長(zhǎng)關(guān)系。在0.1～0.7 mg/mL時(shí)，TBHQ組的還原能力最強(qiáng)(2.38±0.05)，均高于核桃油(0.59±0.06)和復(fù)合核桃油(1.09±0.05)。盡管核桃油和復(fù)合核桃油的還原能力低于TBHQ，然而復(fù)合核桃油的還原能力卻顯著高于純核桃油。多酚類物質(zhì)是良好的電子供體，其供應(yīng)的電子可使Fe3+還原成Fe2+，孫靜濤等[27]證明石榴籽多酚類化合物的還原能力強(qiáng)于相同濃度下的抗壞血酸。結(jié)合筆者之前研究[12]，復(fù)合核桃油的還原能力強(qiáng)于核桃油的原因可能是，20%美藤果油的添加增加了核桃油中的多酚含量。

2.5 復(fù)合核桃油的Fe2+螯合能力

金屬離子可通過(guò)催化活性氧來(lái)氧化一些脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和其他細(xì)胞組分，給機(jī)體造成氧化損傷[28]。因此，對(duì)金屬離子螯合率的測(cè)定也是評(píng)價(jià)物質(zhì)抗氧化活性的常用方法，螯合率越大，則說(shuō)明物質(zhì)的抗氧化活性越強(qiáng)[29]。復(fù)合核桃油的Fe2+螯合能力如圖5所示。

圖5 復(fù)合核桃油的Fe2+螯合能力Fig.5 Fe2+ chelating capacity of blend walnut oil

由圖5可見，隨著復(fù)合核桃油、核桃油和TBHQ質(zhì)量濃度的增大，對(duì)Fe2+螯合能力增強(qiáng)。在1.0～7.0 mg/mL時(shí)，復(fù)合核桃油、核桃油和TBHQ的Fe2+最大螯合率分別為(83.67±1.79)%、(75.74±1.11)%和(26.47±0.14)%，三者對(duì)Fe2+螯合能力的IC50分別為2.5、3.3和15.94 mg/mL，這表明相同質(zhì)量濃度下Fe2+螯合能力大小為：復(fù)合核桃油>核桃油>TBHQ。植物多酚在植物油保護(hù)中，還扮演金屬離子螯合劑的角色[18]。因此，添加20%美藤果油后，核桃油中多酚類物質(zhì)的增加，可能致使復(fù)合核桃油的Fe2+螯合能力增加。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)體外抗氧化實(shí)驗(yàn)，探明了復(fù)合核桃油(核桃油+20%美藤果油)的抗氧化能力。核桃油對(duì)DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基清除能力和Fe2+螯合能力的IC50分別為62.21、1.5、1.7和3.3 mg/mL，添加了20%美藤果油的復(fù)合核桃油相應(yīng)的IC50分別為2.72、0.8、0.9和2.5 mg/mL。結(jié)果顯示，復(fù)合核桃油的抗氧化能力低于TBHQ，顯著強(qiáng)于純核桃油。復(fù)合核桃油的抗氧化能力強(qiáng)于核桃油的原因可能為：添加20%美藤果油后，核桃油中的多酚、生育酚和甾醇等微量組分的含量增加，導(dǎo)致復(fù)合核桃油的抗氧化活性發(fā)生顯著性變化。

本研究結(jié)果表明,20%美藤果油的添加使核桃油的抗氧化活性有顯著性增強(qiáng)，可為核桃油的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)。