朱瑩瑩，趙 瑜，張 麗，汝 驊

(1.蘇州市職業(yè)大學(xué) 教育與人文學(xué)院，江蘇 蘇州 215104；2.蘇州紐邁分析儀器股份有限公司 研發(fā)部，江蘇 蘇州 215151)

驢肉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富、美味可口，與牛肉和豬肉相比，蛋白質(zhì)含量更高，脂肪和膽固醇含量更低[1]，深受消費(fèi)者喜愛(ài)和追捧。但驢的飼養(yǎng)數(shù)量卻呈現(xiàn)逐年下降趨勢(shì)，造成驢肉產(chǎn)量低，價(jià)格居高不下，驢肉摻假問(wèn)題也隨之而來(lái)[2]。目前，我國(guó)尚未建立驢肉產(chǎn)品的定性或定量檢測(cè)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。驢肉的鑒別主要采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)及其衍生技術(shù)、近紅外技術(shù)和化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法、小分子代謝物檢測(cè)、核酸或蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)等[3-8]。其中PCR技術(shù)具有強(qiáng)特異性和高靈敏度，已被廣泛應(yīng)用到肉類成分的檢測(cè)中[9-10]。但該技術(shù)前處理復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)驢肉樣品有破壞性，同時(shí)成本較高，無(wú)法滿足食品質(zhì)量安全部門對(duì)大規(guī)模和高通量檢測(cè)工作的監(jiān)管要求。近紅外技術(shù)因方便、快速、高效、無(wú)損、無(wú)化學(xué)試劑和環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用到農(nóng)畜產(chǎn)品的檢測(cè)中，但近紅外技術(shù)在檢測(cè)前需要建立預(yù)測(cè)模型[11]。

低場(chǎng)核磁共振技術(shù) (low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR)，通過(guò)檢測(cè)樣品中的氫質(zhì)子信號(hào)來(lái)研究樣品中水分、脂肪等物質(zhì)含量或特性，具有無(wú)損、快速、實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)對(duì)樣品形狀、狀態(tài)和大小無(wú)規(guī)定，且對(duì)樣品不產(chǎn)生污染和破壞。目前已被應(yīng)用到注水肉檢測(cè)[12]、牛乳摻假[13]、食用油品質(zhì)鑒別及摻假[14-15]以及黃明膠品牌[16]的快速鑒別上，但還沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道將低場(chǎng)核磁共振技術(shù)應(yīng)用到驢肉的品質(zhì)檢測(cè)或摻假鑒別上。

1 材料與方法

本研究以鹵煮熟驢肉和熟牛肉為研究對(duì)象，擬采用MesoMR23-060H-I低場(chǎng)核磁共振分析儀(蘇州紐邁分析儀器股份有限公司)，及其CPMG(carr purcell meiboom gill)序列檢測(cè)熟驢肉和熟牛肉樣品產(chǎn)生的核磁共振信號(hào)，運(yùn)用儀器配套的反演軟件得到每個(gè)肉樣樣品的橫向弛豫譜及相關(guān)參數(shù)，利用化學(xué)計(jì)量學(xué)中主成分分析技術(shù)，對(duì)采集到的CPMG數(shù)據(jù)進(jìn)行降維分析得到數(shù)據(jù)差異分析結(jié)果，為探索低場(chǎng)核磁共振技術(shù)在驢肉鑒別領(lǐng)域的應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1)肉樣：分別取新鮮牛、驢肉和冷卻至室溫的熟牛、驢肉，切成長(zhǎng)、寬、高約為1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm的肉樣，取10個(gè)樣品，稱重后用于核磁數(shù)據(jù)的檢測(cè)和分析，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量3次，取平均值作為該樣品的最終檢測(cè)結(jié)果用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

2)LF-NMR檢測(cè)方法。在溫度為23.5 ℃，濕度為78.1%的環(huán)境下，在儀器的共振頻率為23.40 MHz，磁體強(qiáng)度為0.55 T，線圈直徑為25 mm，磁體溫度為32 ℃條件下測(cè)試。T2測(cè)試條件：SFO1(MHz)=23.400 MHz，P1=15 us，P2=35.04 us，TE=0.15 ms，Tw=3 000 ms，NECH=5 000，PRG=1，NS=2。

使用核磁共振分析測(cè)量軟件及CPMG序列采集樣品橫向弛豫信號(hào)，采用SIRT 100000進(jìn)行反演，得到牛、驢肉樣品的橫向弛豫圖譜。

3)水分含量的測(cè)定。參照國(guó)標(biāo)《食品中水分的測(cè)定》 (GB5009.3-2016)[17]方法檢測(cè)肉樣中水分含量。水分含量/%=×100%，式中：W為烘干前肉樣的質(zhì)量；W為烘干至質(zhì)量恒定時(shí)肉樣質(zhì)量。

4)統(tǒng)計(jì)分析。用系統(tǒng)自帶的反演軟件對(duì)采集到的CPMG衰減曲線進(jìn)行反演擬合，同時(shí)對(duì)CMPG序列數(shù)據(jù)及反演數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，利用SIMCA-P11.5對(duì)歸一化的CPMG序列數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(principal component analysis，PCA)，使用R3.6.1軟件的hclust對(duì)歸一化的CMPG序列數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，采用Origin8.5.1軟件對(duì)采集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行畫(huà)圖處理。新鮮肉樣和鹵煮肉樣的水分含量用SAS9.2軟件統(tǒng)計(jì)，采用單因素方差分析和Duncan’s多重比較法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果以(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)的形式表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 牛肉和驢肉水分含量分析

測(cè)定新鮮牛、驢肉以及鹵煮熟牛、驢肉的水分含量 (平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)的結(jié)果為：新鮮牛、驢肉肉樣水分含量分別為(69.6±5.1)%、(70.3±2.7)%；鹵煮熟牛肉和熟驢肉的水分含量分別為(43.9±7.1)%、(41.2±4.3)%。由此可知，無(wú)論是新鮮的肉樣還是熟肉樣，牛肉和驢肉樣品之間的含水量均沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)，表明使用水分含量無(wú)法直接鑒別牛肉和驢肉。

2.2 熟牛肉和熟驢肉的弛豫特性分析

熟牛肉和熟驢肉的NMR圖譜如圖1所示。由圖1(a)可知：熟牛肉樣品和熟驢肉樣品的CPMG序列回波峰的衰減曲線間存在一定的差異，其中，熟驢肉表現(xiàn)出更快的衰減速度，表明熟牛肉和熟驢肉內(nèi)部水分含量存在差異。由圖1(b)可知，T2橫向弛豫時(shí)間可以直觀地反映樣品中水分子流動(dòng)性的強(qiáng)弱，熟牛肉和熟驢肉中的水分子主要以自由水(100~1 000 ms)、不易流動(dòng)水(10~100 ms)和結(jié)合水 (0.1~10 ms)三種形式存在。由圖1(c)可知，熟牛肉樣品中結(jié)合水和自由水的占比較熟驢肉高(P<0.05)。因此，熟牛肉和熟驢肉樣品內(nèi)部水分組成狀態(tài)存在顯著差異。

圖1 熟牛肉和熟驢肉樣品的NMR圖譜

2.3 熟牛、驢肉樣品CPMG序列聚類分析和主成分分析

使用R軟件對(duì)熟牛、驢肉樣品的CPMG序列回波峰點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析和主成分分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。聚類分析如圖2(a)所示，主成分分析如圖2(b)所示。

由圖2(a)可知，熟牛肉樣品和熟驢肉樣品的CPMG序列回波峰點(diǎn)數(shù)據(jù)間存在較遠(yuǎn)距離，其弛豫特性存在較大差異。牛肉組內(nèi)10個(gè)樣品間的距離較近，除了8號(hào)驢肉樣品，驢肉組內(nèi)其他9個(gè)樣品間的距離較近，說(shuō)明牛肉和驢肉組內(nèi)差異較小。

由圖2(b)可知，第一主成分PC1貢獻(xiàn)率為82.89%，第二主成分PC2貢獻(xiàn)率為16.03%，PC1和PC2的貢獻(xiàn)率之和超過(guò)98%，說(shuō)明主成分分析可以較完整地反映原來(lái)CPMG多指標(biāo)的數(shù)據(jù)信息，PC1可以將驢肉樣品和牛肉樣品完全分開(kāi)，可以用來(lái)解釋組間差異。PC2可以用來(lái)解釋組內(nèi)差異，點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離越遠(yuǎn)，說(shuō)明樣品差異越大。由此得出：驢肉組樣品和牛肉組樣品間存在較遠(yuǎn)距離，在PC1方向上基本可以得到準(zhǔn)確區(qū)分；驢肉組和牛肉組樣品的CPMG序列回波峰點(diǎn)數(shù)據(jù)間存在顯著差異，可以在PCA得分圖上很好地體現(xiàn)出來(lái)。

低場(chǎng)核磁共振技術(shù)主要通過(guò)研究樣品內(nèi)部氫原子核在永磁場(chǎng)中的自旋弛豫特性，分析樣品的弛豫時(shí)間變化來(lái)研究被測(cè)樣品的氫質(zhì)子特性，尤其是內(nèi)部水分的組成狀態(tài)，如結(jié)合水、自由水、不易流動(dòng)水及其水分含量。熟牛肉和熟驢肉的內(nèi)部水分狀態(tài)存在較大差異，可以直接反映到PCA得分圖上。

圖2 牛、驢肉樣品CPMG序列聚類分析與主成分分析

3 結(jié)論

低場(chǎng)核磁共振技術(shù)在檢測(cè)過(guò)程中無(wú)需添加任何其他化學(xué)試劑，沒(méi)有復(fù)雜的前處理過(guò)程，樣品不會(huì)被污染和破壞，制樣方便，檢測(cè)時(shí)間短，是一種無(wú)損、快速檢測(cè)技術(shù)，結(jié)合主成分分析法，低場(chǎng)核磁共振技術(shù)能有效反應(yīng)熟牛肉和熟驢肉的差異，在驢肉摻假和快速鑒別上具有較大的應(yīng)用潛力。