鄒桂蓮，羅青平，邵華斌，溫國元，楊 燁，商 雨

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽細菌病防治制劑創(chuàng)制重點實驗室/畜禽病原微生物學湖北重點實驗室，武漢 430064；2. 長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434025）

桿狀病毒是一類專職感染無脊椎動物的病毒，病毒呈桿狀，具有囊膜。在其生活周期中共產(chǎn)生兩種形態(tài)不一的病毒粒子，出芽型病毒粒子和包埋型病毒粒子，分別負責病毒的口服感染和系統(tǒng)感染兩個環(huán)節(jié)［1］。桿狀病毒的基因組為雙鏈環(huán)狀DNA，大小為80～180 kb，編碼150 多個病毒蛋白。桿狀病毒分為4 個病毒屬：甲型、乙型、丙型和丁型［2］。

桿狀病毒是目前應用最廣泛的病毒之一。作為安全、高效的生物殺蟲劑被廣泛應用于農(nóng)林業(yè)病蟲害的防治［3，4］；作為表達載體實現(xiàn)外源基因在真核細胞內(nèi)大量表達［5，6］；作為潛在的基因治療載體將藥物基因帶入到靶標細胞內(nèi)并實現(xiàn)表達［7，8］。早期，由于桿狀病毒的基因組較大且不易操作，構(gòu)建重組桿狀病毒是將桿狀病毒的基因組和外源基因片段一起轉(zhuǎn)入到受體細胞內(nèi)，通過同源重組的方法將外源基因替換到病毒基因組上，從而獲得重組桿狀病毒［9］。隨后，為了提高重組桿狀病毒的構(gòu)建效率，將桿狀病毒的基因組線性化后，再與外源基因片段一起轉(zhuǎn)入受體細胞，很大程度提高重組效率。Luckow 等［10］將細菌的復制子插入到桿狀病毒基因組里，構(gòu)建成能在細菌里復制的桿狀病毒基因組—— 桿粒（bacmid）；且在細菌里還可以通過轉(zhuǎn)座的方法將外源基因定點插入到bacmid 上，獲得重組桿狀病毒基因組。以該方法開發(fā)成的Bac-to-Bac 重組桿狀病毒快速構(gòu)建系統(tǒng)被迅速推廣和應用，成千上萬的蛋白被該系統(tǒng)表達。

桿狀病毒作為表達系統(tǒng)有很多顯著的優(yōu)勢：①基因組的容量大，可以攜帶較大的外源基因或多個外源基因［11］；②在昆蟲細胞內(nèi)或昆蟲體內(nèi)表達蛋白，比原核表達系統(tǒng)有更好的翻譯后修飾系統(tǒng)，表達的蛋白更接近天然結(jié)構(gòu)［12］；③桿狀病毒部分基因的啟動子屬于強啟動子，可以實現(xiàn)外源基因在細胞內(nèi)大量表達；④系統(tǒng)操作簡便，重組桿狀病毒構(gòu)建效率高。但是桿狀病毒表達系統(tǒng)也存在一些不足之處：①桿狀病毒的基因組較大，編碼的病毒蛋白較多，對細胞的毒性較大；②桿狀病毒的強啟動子都屬于晚期啟動子，基因表達滯后，細胞內(nèi)病毒蛋白的積累導致外源蛋白的正確折疊受到影響［13］；③昆蟲細胞的翻譯后修飾，尤其是糖基化修飾，與哺乳動物等高等生物細胞有差異，不利于特殊蛋白（如糖蛋白）的表達［14］。

本研究旨在對桿狀病毒進行改造，使之能在哺乳動物或其他高等生物細胞內(nèi)表達外源基因，從而克服桿狀病毒表達系統(tǒng)的不足之處，更大程度地提高表達蛋白的翻譯后修飾。另外，也可以將桿狀病毒作為轉(zhuǎn)導載體，開發(fā)新型、高效的基因治療藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 PCR 酶2×Phanta Max Master Mix（Dye PLus）和T4 DNA 連接酶購自Vazyme 公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自美國Omega 公司；限制性內(nèi)切酶XhoI、EcoR I、Xba I 和Sph I 均購自TaKaRa 公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒QIAGENPlasmid Mini Kits 購 自QIAGEN 公 司；Insect Cell Culture Medium（貼壁）購自NovaStar 公司；Aus-GeneX 澳洲特級胎牛血清購自北京智杰方遠科技有限公司；Cellfectin 轉(zhuǎn)染試劑購自Gibco 公司；硫酸慶大霉素（Gentamycin sulfate，Gen）、氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）、卡那霉素（Kanamycin，Kan）、鏈霉素（Streptomycin，Str）、四環(huán)素（Tet）、IPTG 溶液和Xgal 溶液均購自Solarbio 公司。

1.1.2 病毒基因、載體和細胞 pcDNA3.1、pcDNAmCherry、pFastBac-Dual 質(zhì)粒、pTS09-C-egfp 和Sf9昆蟲細胞均由本實驗室保存。哺乳動物DNA 從BHK-21 細胞中提取。DH5α 感受態(tài)購自大連TaKa-Ra 公司。含有桿狀病毒基因組（AcBac-Δcc）和helper 質(zhì)粒的BW25113 大腸桿菌菌株由本試驗制備。

1.2 方法

1.2.1 CMV 啟動子（PCMV）和EF1 啟動子（PEF1）的克隆 根據(jù)PCMV序列和PEF1序列設計引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以pcDNA3.1 為模板，用引物對PCMV-F 和PCMV-R 擴增PCMV；以哺乳動物DNA 為模板，用引物對PEF1-F 和PEF1-R 擴增PEF1。通過1% 的瓊脂糖凝膠電泳回收PCMV和PEF1擴增產(chǎn)物。PCMV和PEF1片段通過Overlapping PCR 融合形成PCMV-PEF1片段，通過1% 的瓊脂糖凝膠電泳回收擴增產(chǎn)物。

表1 試驗所用引物

1.2.2 重組表達載體pFastBac-2EP 的構(gòu)建 分別用XhoI 和EcoR I 雙酶切PCMV-PEF1和pFastBac-Dual，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的條帶，用凝膠回收試劑盒回收目的片段。10 μL T4 DNA 連接酶體系中，按摩爾比（3～10）∶1 加入回收后的目的片段和載體，在4 ℃連接過夜。取5 μL 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入100 μL DH5α 感受態(tài)細胞中，取100 μL 菌液涂布于含Amp（10 μg/mL）和Gen（10 μg/mL）的LB 營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落進行菌液培養(yǎng)，利用引物PCMV-F 和PEF1-R 對菌液進行PCR 檢測，提取陽性菌液的質(zhì)粒，命名為pFastBac-2EP，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3 質(zhì)粒pFastBac-2EP-mCherry-egfp 的構(gòu)建根據(jù)mCherry 和egfp 基因序列分析，設計引物對（EGFP-F、EGFP-R）和引物對（mCherry-F、mCherry-R）（表1），以pcDNA-mCherry 和PTS09-C-egfp為模板，擴增mCherry 和egfp 基因序列。通過酶切和連接的方法，先后將egfp 和mCherry 基因插入到pFastBac-2EP 質(zhì)粒PEF1下游的EcoR I 和Xba I 限制性內(nèi)切酶位點之間和PCMV下游的Xho I 和Sph I 限制性內(nèi)切酶位點之間。構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入DH5α 感受態(tài)細胞，涂布平板，培養(yǎng)至長出單菌落后挑取單菌落進行菌液培養(yǎng)。經(jīng)PCR 鑒定和酶切鑒定后，挑選構(gòu)建正確的質(zhì)粒進行測序分析，將測序正確的質(zhì)粒命名為pFastBac-2EP-mCherry-egfp（圖1）。

1.2.4 重組質(zhì)粒pAc-2EP-mCherry-egfp 的構(gòu)建取50 ng 質(zhì)粒pFastBac-2EP-mCherry-egfp 轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌BW25113 株感受態(tài)細胞（含AcBac-Δcc bacmid 和helper 質(zhì)粒），菌液涂布于LB 平板（含Kan 50 μg/mL；Tet 50 μg/mL；Gen 10 μg/mL；IPTG 48 μg/mL 和X-gal 80 μg/mL），37 ℃培養(yǎng)48 h。挑取白色單菌落進行菌液培養(yǎng)，通過PCR 鑒定外源基因是否插入到桿狀病毒基因組上。使用引物對Gen-F 和LacZ-R 以及引物對LacZ-F 和PEF1-R 來進行檢測（表1），其中引物LacZ-F 和LacZ-R 位于桿狀病毒基因組轉(zhuǎn)座位點兩側(cè)，引物Gen-F 和PEF1-R 位于pFastBac-2EP-mCherry-egfp 質(zhì)粒上。檢測陽性的重組桿狀病毒基因組命名為pAc-2EPmCherry-egfp。用QIAGENPlasmid Mini Kits 試劑盒提取重組桿狀病毒基因組。

1.2.5 重組病毒rAc-2EP-mCherry-egfp 的拯救六孔板中Sf9 細胞生長至70%～80% 時，根據(jù)Cellfectin 轉(zhuǎn)染試劑說明書，將5 μg pAc-2EP-mCherryegfp 重組桿狀病毒基因組DNA 轉(zhuǎn)染到Sf9 細胞，置于27 ℃培養(yǎng)箱孵育4～5 d，每天觀察細胞病變。收取培養(yǎng)上清，5 000 r/min 離心5 min，去除細胞碎片。收獲的細胞培養(yǎng)上清液繼續(xù)感染Sf9 細胞，獲得高滴度的重組桿狀病毒命名為rAc-2EP-mCherryegfp。

1.2.6 重組桿狀病毒感染Sf9 細胞和轉(zhuǎn)導BHK-21細胞 六孔板中每孔鋪入106Sf9 細胞。待細胞貼壁后，重組桿狀病毒rAc-2EP-mCherry-egfp 以1 MOI的感染劑量感染Sf9 細胞。27 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d，每天觀察細胞內(nèi)紅色熒光和綠色熒光的產(chǎn)生情況。

六孔板中每孔鋪入2×105BHK-21 細胞。待細胞貼壁后，重組桿狀病毒rAc-2EP-mCherry-egfp 以10 MOI 的感染劑量感染BHK-21 細胞。37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，每天觀察細胞內(nèi)紅色熒光和綠色熒光的產(chǎn)生情況。

圖1 Donor 質(zhì)粒構(gòu)建流程

2 結(jié)果與分析

2.1 donor質(zhì)粒pFastBac-2EP 的構(gòu)建

根據(jù)所設計的引物，擴增出來的片段PCMV和PEF1大小分別位于250～500 bp 和500～750 bp，與片段預期的大?。ǚ謩e為375 和574 bp）相符。再通過Overlapping PCR 將PCMV和PEF1融合在一起獲得大小為750～1 000 bp 的片段PCMV-PEF1（圖2A），大小與預期大?。?46 bp）相符。將PCMV-PEF1插入到pFast-Bac-Dual 質(zhì)粒的XhoI 和EcoR I 酶切位點后，獲得改造的donor 質(zhì)粒pFastBac-2EP，質(zhì)粒PCR 鑒定和酶切鑒定結(jié)果（圖2B 和圖2C）均表明質(zhì)粒構(gòu)建正確。進一步將質(zhì)粒交由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，結(jié)果表明插入片段沒有發(fā)生點突變。因此該donor 質(zhì)?？捎糜谙掠卧囼灐?/p>

圖2 啟動子擴增結(jié)果和pFastBac-2EP 構(gòu)建的鑒定結(jié)果

2.2 質(zhì)粒pFastBac-2EP-mCherry-egfp 的構(gòu)建

圖3 質(zhì)粒pFastBac-2EP-mCherry-egfp 構(gòu)建過程中的電泳

根據(jù)所設計引物擴增mCherry 和egfp 基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到711 和729 bp 的兩條條帶（圖3A），條帶大小與預期相符。將目的片段mCherry 和egfp 片段通過酶切連接的方法分別插入PCMV和PEF1下游，構(gòu)建重組質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶Xho I 和Sph I 以及EcoR I 和Xba I 分別對重組質(zhì)粒進行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，表明酶切樣品均能產(chǎn)生2 條條帶（圖3B），大小與預期結(jié)果相符合。將鑒定正確的質(zhì)粒交由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，結(jié)果顯示插入序列沒有發(fā)生突變，表明pFastBac-2EP-mCherry-egfp 構(gòu)建成功。

2.3 重組質(zhì)粒pAc-2EP-mCherry-egfp 的構(gòu)建

將pAc-2EP-mCherry-egfp 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌BW25113 株感受態(tài)細胞（含AcBac-Δcc bacmid 和helper 質(zhì)粒）中，經(jīng)Blue-Gal 藍白斑篩選，挑取白色單菌落進行菌液培養(yǎng)。 用引物Gen-F 和LacZ-R 以及LacZ-F 和PEF1-R 兩組引物進行菌液PCR 鑒定，兩組引物擴增的片段大小分別為750 和1 200 bp 左右（圖4），擴增結(jié)果與預期結(jié)果一致，表明重組桿狀病毒基因組構(gòu)建正確。

圖4 重組桿狀病毒基因組鑒定結(jié)果

2.4 重組病毒的拯救

將重組桿狀病毒基因組pAc-2EP-mCherryegfp 轉(zhuǎn)染Sf9 細胞。72 h 后觀察到細胞開始出現(xiàn)病變，主要表現(xiàn)為細胞腫脹以及細胞核膨脹，96 h 后大部分細胞出現(xiàn)病變，120 h 后收集細胞培養(yǎng)上清。將收集的細胞培養(yǎng)上清液感染Sf9 細胞，每天觀察細胞的病變。結(jié)果表明，感染后48 h 細胞開始出現(xiàn)病變，96 h 后大部分細胞出現(xiàn)典型的桿狀病毒病變（圖5）。收集病毒進行病毒滴度測定，病毒滴度達到1.8×108TCID50/mL。

圖5 重組桿狀病毒感染Sf9 細胞的病變觀察

2.5 重組桿狀病毒感染Sf9 細胞和BHK-21 細胞

用1 MOI 重組病毒rAc-2EP-mCherry-egfp 感染Sf9 細胞，觀察熒光變化情況。病毒在感染24 h后出現(xiàn)紅色熒光和綠色熒光，但熒光較暗，隨后熒光慢慢增強；96 h 后，紅色熒光和綠色熒光強度非常高（圖6A 和圖6B）。用10 MOI 重組病毒rAc-2EPmCherry-egfp 轉(zhuǎn)導BHK-21 細胞，觀察發(fā)現(xiàn)，48 h 開始出現(xiàn)微弱的綠色和紅色熒光，隨后熒光逐漸增強；120 h 后，熒光強度也增強的非常高（圖6C 和圖6D），表明桿狀病毒可以進入BHK-21 細胞，且PCMV和PEF1可作為桿狀病毒表達載體的啟動子在Sf9 細胞和BHK-21 細胞中持續(xù)表達蛋白。

圖6 rAc-2EP-mCherry-egfp 感染Sf9 細胞和BHK-21 細胞的熒光

3 小結(jié)與討論

桿狀病毒作為一種安全、高效的表達載體，應用越來越廣泛，但是由于桿狀病毒感染宿主細胞會大量合成病毒蛋白和組裝桿狀病毒，導致細胞快速凋亡，以及糖基化修飾方式與其他的高等生物細胞不一致，極大影響了蛋白表達產(chǎn)量、結(jié)構(gòu)和功能，提高了純化難度［15］。為了解決這些問題，研究者們也采取了系列措施，如精簡桿狀病毒基因組［16］、攜帶抑制細胞凋亡的基因［17］和引入其他高等生物細胞的糖基化修飾系統(tǒng)［18］，對改良桿狀病毒的應用起到一定作用。本研究旨在構(gòu)建一個能在哺乳動物細胞內(nèi)高效表達外源蛋白的重組桿狀病毒，可以禁止桿狀病毒蛋白在細胞內(nèi)的表達，不會引起細胞病變的產(chǎn)生，還可以利用哺乳動物細胞的蛋白翻譯后修飾系統(tǒng)。

因為桿狀病毒具有強大的膜融合蛋白（GP64），能介導桿狀病毒與多物種的細胞發(fā)生膜融合，將桿狀病毒的核衣殼轉(zhuǎn)導進入細胞內(nèi)，但轉(zhuǎn)導效率在不同細胞上的差異較大［19］。桿狀病毒的啟動子一般不會被其他物種細胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)識別，因此首先替換了桿狀病毒表達系統(tǒng)中表達外源基因的啟動子，將表達載體中的p10 和PH 啟動子替換成CMV 和EF1 基因的啟動子。這兩種啟動子均被廣泛應用于各種真核表達載體的構(gòu)建。為了驗證改造后的啟動子能否發(fā)揮作用，分別將紅色熒光蛋白mCherry 基因和綠色熒光蛋白egfp 基因插入到CMV 和EF1 啟動子下游，然后經(jīng)過轉(zhuǎn)座構(gòu)建重組桿狀病毒基因組，再經(jīng)轉(zhuǎn)染試驗，獲得重組桿狀病毒。重組桿狀病毒在感染Sf9 昆蟲細胞時，可以產(chǎn)生紅色和綠色熒光，表明CMV 和EF1 啟動子可以在昆蟲細胞內(nèi)工作；當重組桿狀病毒孵育BHK-21 細胞時，細胞在48 h后才開始產(chǎn)生熒光，隨后熒光強度才逐漸變強，桿狀病毒可以將外源基因轉(zhuǎn)導進入BHK-21 細胞，且CMV 和EF1 啟動子可以在BHK-21 細胞內(nèi)持續(xù)工作。后期將在此基礎上，對哺乳動物細胞系和家禽細胞系進行篩選，選擇適合的轉(zhuǎn)導細胞系；另外還將從提高轉(zhuǎn)導效率和入核效率等方面對桿狀病毒載體進行優(yōu)化，進一步提高桿狀病毒載體的應用性能。