葉興枝，程 群，張等宏，徐 怡，陳巧玲，陳火云

（湖北恩施中國南方馬鈴薯研究中心/恩施土家族苗族自治州農(nóng)業(yè)科學院，湖北 恩施 445000）

生姜（Zingiber officinale Roscoe）為姜科姜屬多年生宿根植物，有健脾開胃、溫中止嘔、止咳祛痰、提神活血之功能，有祛寒御濕、延緩衰老、防癌美容之功效，還可提取姜油酮、姜油、香精等醫(yī)藥化工用品［1］。近年來以生姜為原料的保鮮生姜及生姜加工制品大量出口日本及東南亞諸國，成為中國出口創(chuàng)匯的重要產(chǎn)品。

鳳頭姜塊根肥脆，白嫩的塊根緊連成扇形，頂上還有點點紅蒂，像傳說中鳳凰的頭，因此得名鳳頭姜，其鮮子姜無筋脆嫩、富硒多汁、辛辣適中、美味可口，遠銷東南亞市場。

由于鳳頭姜不易開花結(jié)實，不能利用有性繁殖進行大批量育種，生產(chǎn)上長期以成熟根狀莖為種源進行無性繁殖，其繁殖系數(shù)低、多種病毒積累，造成種性退化、產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降［2］。目前國內(nèi)外對生姜病毒的防治仍沒有特效藥，加之多年來生姜品種得不到更新改良，致使鳳頭姜極易感染多種病毒，阻礙了鳳頭姜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本試驗旨在研究鳳頭姜的組培快繁技術(shù)，切實解決阻礙鳳頭姜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問題，推動鳳頭姜產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用無病蟲害、塊大、粗壯、皮色鮮艷的鳳頭姜，洗去泥土，用50% 多菌靈800 倍稀釋液浸泡15 min，晾干。

1.2 方法

1.2.1 催芽 將處理后的種姜置于消過毒的沙盤中，用細砂覆蓋，噴水至細沙濕潤（切勿積水），然后將消毒盤置于人工培養(yǎng)箱內(nèi)催芽。

1.2.2 莖尖剝離 待種姜芽點萌發(fā)至1～2 cm 時，選取粗壯的芽，用解剖刀切下，放入器皿中流水沖洗30 min，然后轉(zhuǎn)入超凈工作臺進行操作。將其放入無菌燒杯內(nèi)，用75% 乙醇清洗30 s，0.1% HgCl2浸泡15～20 s，5% 次氯酸鈉浸泡8～10 min，無菌水沖洗2～3 次。再將其放在無菌濾紙上吸干水分，在解剖鏡下剝?nèi)? 個葉原基的莖尖，接種于脫分化培養(yǎng)基上，每瓶接種1 個莖尖。

1.2.3 離體培養(yǎng)

1）脫分化培養(yǎng)。將莖尖接種于脫分化培養(yǎng)基中，記錄接種5 周后愈傷組織形成情況及出愈率，篩選最佳培養(yǎng)基。

2）再分化培養(yǎng)。當莖尖明顯伸長，葉原基形成可見小葉時，接種于再分化培養(yǎng)基中，觀察記錄出芽時間，統(tǒng)計出芽率及成活率，篩選最佳培養(yǎng)基。

3）生根壯苗培養(yǎng)。當叢生芽生長至4～5 cm 時，取出整株并將其分割成帶有1～2 個小芽，保留基部，留莖1～2 cm，接種于生根壯苗培養(yǎng)基中。觀察生根及芽分蘗情況，統(tǒng)計生根率、成苗率及增殖倍數(shù)，篩選最佳培養(yǎng)基。

以上所有培養(yǎng)基均以MS 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加不同激素，pH 5.8，其中成活指莖尖發(fā)育為可見的綠點，成活率為成活莖尖個數(shù)與接種莖尖個數(shù)之比；成苗指成活莖尖長出帶有兩個以上葉片的小植株，成苗率為成苗莖尖個數(shù)與接種莖尖個數(shù)之比［3］。增殖系數(shù)為增殖后芽苗總數(shù)與接種莖尖個數(shù)之比。脫毒率為成苗莖尖中經(jīng)病毒檢測后不帶病毒的莖尖個數(shù)與成苗莖尖個數(shù)之比。

1.2.4 培養(yǎng)條件 溫度（25±2）℃，光照度2 000～3 000 lx，光照時間14～16 h/d，相對濕度70%～80%。

1.2.5 病毒檢測 每個株系隨機抽取1%～2% 生長健壯的苗進行檢測，檢測對象為煙草花葉病毒（TMV）和黃瓜花葉病毒（CMV），確定不帶病毒（或不帶主要危害病毒）才能用于大量擴繁。

1.2.6 脫毒苗繼代培養(yǎng) 經(jīng)病毒檢測確定不帶毒的試管苗，去掉根及老葉，分割成帶有1～2 個小芽，保留基部，留取1～2 cm 莖段，接種于生根壯苗培養(yǎng)基中擴繁。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素對愈傷組織的影響

在MS 培養(yǎng)基中添加不同濃度6-BA、NAA 和有機成分，接種培養(yǎng)5 周后，①、②、④和⑤號脫分化培養(yǎng)基所誘導的愈傷組織結(jié)構(gòu)緊密，質(zhì)量較好，成活率均高于90%；③號脫分化培養(yǎng)基所誘導的愈傷組織松散，出愈率和成活率均明顯低于其他4 種培養(yǎng)基。結(jié)果表明，6-BA 與NAA 配合使用能誘導出高質(zhì)量的愈傷組織，能明顯提高莖尖的成活率；有機成分對愈傷組織的形成及成活率的作用不明顯。當NAA 為0.1 mg/L 時，適當調(diào)整6-BA 濃度，能明顯影響莖尖的出愈率（表1）。經(jīng)過多次比較試驗，綜合成本因素，確定①號脫分化培養(yǎng)基是誘導鳳頭姜莖尖愈傷組織形成的最好配方。

表1 不同培養(yǎng)基對愈傷組織的影響

2.2 不同激素濃度對幼芽分化的影響

將莖尖分化的愈傷組織分別接種到2 種再分化培養(yǎng)基上，經(jīng)過5 周培養(yǎng)，①號再分化培養(yǎng)基中愈傷組織分化的叢生芽纖細，莖葉淡黃，將纖細叢生芽分割后再次接種于相同培養(yǎng)基，經(jīng)過5 周培養(yǎng)，分化出的叢生芽仍然纖細；②號再分化培養(yǎng)基中愈傷組織形成的叢生芽多，苗粗壯，莖葉翠綠。②號再分化培養(yǎng)基叢生芽的出芽時間比①號培養(yǎng)基早6 d，出芽率也明顯高于①號培養(yǎng)基（表2），經(jīng)過反復驗證，②號再分化培養(yǎng)基是誘導鳳頭姜叢生芽形成的最好配方。

2.3 不同濃度激素對試管苗生根的影響

鳳頭姜試管苗很容易生根，但在不同培養(yǎng)基上生根數(shù)量、粗細、長度及芽分蘗有所不同。只有在激素濃度適宜的MS 培養(yǎng)基上才能實現(xiàn)根系快速生長，而且根系粗壯，生根多，分蘗也多。由表3 可以看出，生根數(shù)及繁殖系數(shù)隨著6-BA 和NAA 濃度配比適當增加而增加，但對生根率和成苗率的影響不大。以MS+6-BA（1.0 mg/L）+NAA（0.3 mg/L）為培養(yǎng)基對生根及繁殖系數(shù)的作用最大。

表2 不同培養(yǎng)基對出芽及成活率的影響

表3 不同培養(yǎng)基對生根的影響

3 討論

近年來，對生姜組培快繁技術(shù)的研究報道日益增多，莖尖培養(yǎng)是目前使用最廣泛的脫毒方法［4-8］。培養(yǎng)基配方、莖尖大小、病毒種類及培養(yǎng)條件等均能制約生姜的莖尖脫毒效果，其中最為關(guān)鍵的是培養(yǎng)基成分與濃度的選配［9-13］。基因型不同對培養(yǎng)基的需求有所不同，只有選用適合的培養(yǎng)基，才能培育出高質(zhì)量的鳳頭姜脫毒種苗。本研究發(fā)現(xiàn)，加入6-BA 的脫分化培養(yǎng)基的莖尖出愈率及成活率明顯高于未添加的，一定濃度的6-BA 和NAA 配合使用能誘導愈傷組織形成［14-17］；NAA 能促進細胞伸長生長、細胞分裂及生根，但是濃度超過0.3 mg/L，根的生長速度反而下降［18-20］。本試驗構(gòu)建的鳳頭姜快繁體系不僅提高了鳳頭姜組培苗的成活率和脫毒率，還快速提升了鳳頭姜的繁殖系數(shù)。