李進(jìn)波，杜雪樹，夏明元，萬丙良，戚華雄

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所/糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064）

水稻（Oryza sativa L.）是世界上主要的糧食作物，但在生長(zhǎng)期間會(huì)受到許多病蟲害的為害，其中稻瘟病和褐飛虱是水稻的兩大主要病蟲害。目前，防治水稻稻瘟病和褐飛虱的主要途徑是使用化學(xué)農(nóng)藥和種植抗性品種。但化學(xué)藥劑的使用會(huì)對(duì)自然環(huán)境造成污染、增加成本、增大稻谷中的農(nóng)藥殘留量等，而種植抗病蟲品種既經(jīng)濟(jì)有效又對(duì)環(huán)境友好。因此，培育具有多種抗性的水稻品種對(duì)于防治水稻稻瘟病和褐飛虱具有重要意義。

20 世紀(jì)60 年代中期，日本率先開展了水稻抗稻瘟病基因的研究工作，鑒定了最初的8 個(gè)抗性位點(diǎn)上的14 個(gè)基因，并建立了一套抗稻瘟病基因的鑒別體系。隨后，國際水稻研究所和中國等產(chǎn)稻國也逐漸開展了水稻稻瘟病抗性遺傳的系統(tǒng)性研究。截至2015 年3 月，已至少報(bào)道了69 個(gè)抗稻瘟病位點(diǎn)共84 個(gè)主效基因，24 個(gè)抗稻瘟病基因被成功克?。?］。其中Pi1 和Pi2 基因是2 個(gè)顯性廣譜抗稻瘟病基因，對(duì)中國各稻區(qū)菌株表現(xiàn)為廣譜抗性，在抗稻瘟病抗性育種中具有重要的應(yīng)用價(jià)值［2］。Pi1 被定位在第11 染色體長(zhǎng)臂末端，與SSR 標(biāo)記MGR4766 的遺傳距離為1.3 cM，研究表明MGR4766 對(duì)Pi1 進(jìn)行選擇的準(zhǔn)確率可達(dá)98%～100%［3］。Pi2 被定位在第6 染色體的短臂上，與SSR 標(biāo)記AP22 的遺傳距離為1.2 cM［4］，研究表明AP22 對(duì)Pi2 進(jìn)行選擇的準(zhǔn)確率可達(dá)97%［5］。上述研究為利用分子標(biāo)記輔助選擇Pi1 和Pi2 基因培育抗稻瘟病水稻品種奠定了基礎(chǔ)。

自20 世紀(jì)70 年代起，各國相繼開展了水稻褐飛虱抗性基因的發(fā)掘工作，截至目前，從秈稻和野生稻中至少鑒定了27 個(gè)抗褐飛虱基因［6］，為培育抗褐飛虱水稻品種奠定了基礎(chǔ)。Huang 等［7］從帶有藥用野生稻背景的滲入系B5 中鑒定了2 個(gè)顯性抗褐飛虱基因Bph14 和Bph15，將它們分別定位在水稻第3 染 色 體 和 第4 染 色 體 上。 隨 后，Yang 等［8］將Bph15 基因定位于47 kb 范圍，并開發(fā)了一些與之緊密連鎖的SSR 標(biāo)記。在這些研究的基礎(chǔ)上，利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)將抗褐飛虱基因Bph14 和Bph15 導(dǎo)入到雜交稻親本中，已經(jīng)成功地選育出抗褐飛虱的雜交稻親本和雜交組合［9］。

R022 是湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所選育的攜帶抗褐飛虱基因Bph14 和Bph15 的恢復(fù)系，以其姊妹系鄂恢108 為父本配制的雜交組合巨風(fēng)優(yōu)108（巨風(fēng)2A/鄂恢108）于2015 年通過湖北省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定，但區(qū)域試驗(yàn)抗性鑒定結(jié)果顯示巨風(fēng)優(yōu)108 稻瘟病抗性綜合指數(shù)為6.5，穗瘟損失率最高級(jí)9 級(jí)，高感稻瘟病。為了改良巨風(fēng)優(yōu)108 的稻瘟病抗性，本研究以R022 為輪回親本、GD7 為供體親本，通過分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)將抗稻瘟病基因Pi1、Pi2 與抗褐飛虱基因Bph14、Bph15聚合，培育同時(shí)具有稻瘟病抗性和褐飛虱抗性的水稻恢復(fù)系和雜交組合。

1 材料與方法

1.1 材料

輪回親本R022 是湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所培育的抗褐飛虱恢復(fù)系，攜帶抗褐飛虱基因Bph14 和Bph15。供體親本GD7 是廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所培育的抗稻瘟病品種，攜帶抗稻瘟病基因Pi1 和Pi2。

1.2 分子標(biāo)記和檢測(cè)方法

利用分子標(biāo)記MRG4766、AP22、76-2 和MS5分別檢測(cè)Pi1、Pi2、Bph14 和Bph15 基因，分子標(biāo)記的引物信息和PCR 反應(yīng)程序見表1，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

PCR 反應(yīng)體系總體積為15 μL，包括1.5 μL 10×buffer，1.2 μL dNTPs（各2.5 mmol），引物各0.3 μL（10 μmol），1 U Taq DNA 聚合酶，50 ng 模板DNA，最后用dd H2O 補(bǔ)足至15 μL。Taq DNA 聚合酶和其他相關(guān)試劑均購自Takara（Dalian，China）公司。PCR 反應(yīng)在GenAmp PCR System 9700（Applied Biosystems）中進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物用0.6% 的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，結(jié)合銀染顯色檢測(cè)。

1.3 雜交和選擇程序

以R022 為母本、GD7 作父本雜交獲得雜交種F1，再以R022 作輪回親本連續(xù)回交3 次，然后自交4 次獲得BC3F5株系。在回交過程中從BC1F1開始用分子標(biāo)記檢測(cè)抗稻瘟病基因Pi1 和Pi2，選擇帶有Pi1 和Pi2 基因且農(nóng)藝性狀偏向R022 的單株作父本。在BC3F2中選擇農(nóng)藝性狀優(yōu)良的株系逐株檢測(cè)Pi1 和Pi2 基因，選擇Pi1 和Pi2 基因純合的單株再檢測(cè)Bph14 和Bph15 基因。

1.4 雜交組合的配制

在BC3F4代選擇遺傳背景與R022 最接近的株系R650 作父本，與3 個(gè)不育系巨風(fēng)2A、天豐A 和內(nèi)香5A 分別配制雜交組合，同時(shí)輪回親本R022 與不育系配制對(duì)應(yīng)的雜交組合。

表1 目標(biāo)基因的引物信息和PCR 反應(yīng)程序

1.5 稻瘟病抗性鑒定

在湖北省恩施州農(nóng)業(yè)科學(xué)院稻瘟病自然鑒定圃對(duì)R022、R650 及相應(yīng)的雜交組合巨風(fēng)2A/R650、天豐A/R650、內(nèi)香5A/R650、巨風(fēng)2A/R022、天豐A/R022、內(nèi)香5A/ R022 進(jìn)行稻瘟病鑒定。

1.6 褐飛虱抗性鑒定

褐飛虱抗性鑒定采用苗期集團(tuán)鑒定法，將R022、R650 及相應(yīng)的雜交組合巨風(fēng)2A/R650、天豐A/R650、內(nèi) 香5A/R650、巨 風(fēng)2A/R022、天 豐A/R022、內(nèi)香5A/ R022 及感蟲對(duì)照品種Taichung Native1（TN1）催芽后的種子播在塑料盒中（60 cm×40 cm×10 cm），每處理1 行，播20 粒左右，行長(zhǎng)20 cm，行距5 cm，正常水肥管理。待苗長(zhǎng)至三葉一心時(shí)，每行取健壯一致的幼苗15 株用于接蟲鑒定。按每株10 頭2～3 齡若蟲接蟲，重復(fù)3 次。褐飛虱為稻田采集的混合群體，主要包含生物型Ⅱ，采集后在TN1 上飼養(yǎng)繁殖。當(dāng)感蟲對(duì)照品種TN1 死苗率達(dá)95% 左右時(shí)，調(diào)查其他鑒定材料的苗情，根據(jù)死苗率評(píng)定抗性級(jí)別。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：死苗率≤1.0%，級(jí)別為0，免疫；死苗率在1.1%～10.0%，級(jí)別為1，高抗；死苗率在10.1%～30.0%，級(jí)別為3，抗；死苗率在30.1%～50.0%，級(jí)別為5，中抗；死苗率在50.1%～70.0%，級(jí)別為7，中感；死苗率≥70.1%，級(jí)別為9，感。

1.7 農(nóng)藝性狀的考查

R650、R022 及相應(yīng)的雜交組合巨風(fēng)2A/R650、天豐A/R650、內(nèi)香5A/R650、巨風(fēng)2A/R022、天豐A/R022、內(nèi)香5A/R022 種植在武漢市大田中，隨機(jī)區(qū)組排列，3 次重復(fù)，每重復(fù)小區(qū)長(zhǎng)6.7 m，寬2.0 m，每小區(qū)插10 行，每行40 穴，株行距16.7 cm×20.0 cm，成熟后每小區(qū)取樣10 穴，分別考查株高、單株穗數(shù)、穗長(zhǎng)、每穗總粒數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)、千粒重、結(jié)實(shí)率等重要農(nóng)藝性狀，剩余材料全部收割測(cè)產(chǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子標(biāo)記輔助選擇及目標(biāo)基因純合系的獲得

利用與Pi1 和Pi2 基因緊密連鎖的SSR 標(biāo)記MRG4766 和AP22 對(duì)抗性基因供體親本GD7 和受體親本R022 進(jìn)行多態(tài)性分析。MRG4766 在供體親本中擴(kuò)增產(chǎn)物片段較大，在R022 中擴(kuò)增產(chǎn)物片段較??；AP22 在供體親本中擴(kuò)增產(chǎn)物片段較小，在R022 中擴(kuò)增產(chǎn)物片段較大，MRG4766 和AP22 在供體親本GD7 和受體親本R022 之間都具有多態(tài)性（圖1）。

圖1 抗性基因Pi1 和Pi2 的連鎖標(biāo)記在BC1F1至BC3F1群體中的分離

分子標(biāo)記輔助選擇結(jié)合回交育種按以下程序進(jìn)行：供體親本與受體親本R022 雜交，鑒定F1真假雜種后與R022 回交。在BC1F1群體中，經(jīng)分子標(biāo)記檢測(cè)獲得同時(shí)帶有Pi1 和Pi2 基因的單株（圖1），從中選擇農(nóng)藝性狀與輪回親本接近的單株作父本取混合花粉繼續(xù)與R022 回交得到BC2F1。經(jīng)分子標(biāo)記檢測(cè)獲得帶有Pi1 和Pi2 基因的單株，選擇農(nóng)藝性狀與輪回親本相似的單株作父本取混合花粉繼續(xù)與R022 回交得到BC3F1。經(jīng)分子標(biāo)記檢測(cè)獲得帶有Pi1 和Pi2 基因的單株套袋自交，分單株收種后種植成BC3F2株系，插秧一周后對(duì)每個(gè)單株定株編號(hào)取葉片備用。在分蘗期和抽穗期比較株系與輪回親本R022 的性狀差異，從中選擇基本整齊一致、農(nóng)藝性狀優(yōu)良且與R022 最相似的10 個(gè)株系。在收種前對(duì)這10 個(gè)株系所有單株的Pi1 和Pi2 基因進(jìn)行檢測(cè)，共獲得Pi1 和Pi2 基因均純合的單株48 個(gè)（圖2）。然后用分子標(biāo)記76-2 和MS5 分別檢測(cè)這48 個(gè)單株的Bph14 和Bph15 基因，其中44 個(gè)單株的Bph14 和Bph15 基因均為純合（圖3），即獲得Pi1、Pi2 和Bph14、Bph15 這4 個(gè)基因都純合的單株44 個(gè)。最后從7 個(gè)株系中選擇50 個(gè)單株種植成BC3F4株系，經(jīng)田間表型觀察這些株系的農(nóng)藝性狀已基本穩(wěn)定，通過田間農(nóng)藝性狀的進(jìn)一步比較，從BC3F4株系中選擇36 個(gè)單株形成BC3F5株系。根據(jù)BC3F5株系田間農(nóng)藝性狀表現(xiàn)，綜合性狀優(yōu)良的株系C650 入選，暫定名為R650。

圖2 抗性基因Pi1 和Pi2 的連鎖標(biāo)記在BC3F2群體中的分離

圖3 抗性基因Bph14 和Bph15 的連鎖標(biāo)記在BC3F2群體中的分離

2.2 稻瘟病抗性評(píng)價(jià)

在湖北省恩施州農(nóng)業(yè)科學(xué)院稻瘟病自然鑒定圃對(duì)GD7、R022、R650 及相應(yīng)的雜交組合進(jìn)行稻瘟病鑒定，結(jié)果見表2。由表2 可知，R650 和供體親本GD7 表現(xiàn)為抗，而受體親本R022 表現(xiàn)為高感，R650的抗性明顯強(qiáng)于R022 的抗性。雜交組合巨風(fēng)2A/R650、天豐A/R650、內(nèi)香5A/R650 的抗性綜合指數(shù)在2.5～4.3，表現(xiàn)為中抗或中感；而巨風(fēng)2A/R022、天豐A/R022、內(nèi)香5A/R022 的抗性綜合指數(shù)在5.3～6.8，表現(xiàn)為中感或感，R650 配制的雜交組合的稻瘟病抗性明顯強(qiáng)于受體親本R022 配制的相應(yīng)雜交組合的抗性，說明利用分子標(biāo)記輔助選擇Pi1 和Pi2基因培育抗稻瘟病的恢復(fù)系和雜交組合是一種有效的途徑。

2.3 褐飛虱抗性評(píng)價(jià)

采用苗期集團(tuán)鑒定法鑒定R650、R022 及其雜交組合的褐飛虱抗性，鑒定結(jié)果表明R650 和R022抗性為3 級(jí)，表現(xiàn)為抗，R650 和R022 配制的雜交組合的抗性為5 級(jí)，均表現(xiàn)為中抗，而對(duì)照TN1 的抗性為9 級(jí)，表現(xiàn)為感，說明通過回交轉(zhuǎn)育和分子標(biāo)記輔助選擇Bphl4 和Bph15 基因，育成品種的抗性能保持輪回親本的抗性。R650 和R022 的抗性強(qiáng)于其雜交組合的抗性，說明Bphl4 和Bph15 基因在純合狀態(tài)下的抗性強(qiáng)于雜合狀態(tài)下的抗性。

2.4 農(nóng)藝性狀考查

對(duì)R650、R022 及其雜交組合的主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行了考查，結(jié)果見表3。由表3 可知，R650 的基本農(nóng)藝性狀與R022 相似，雜交組合巨風(fēng)2A/R650、天豐A/R650 和內(nèi)香5A/R650 與對(duì)應(yīng)的巨風(fēng)2A/R022、天豐A/R022 和內(nèi)香5A/R022 比較，在產(chǎn)量構(gòu)成性狀上沒有明顯的差異，小區(qū)產(chǎn)量基本在同一水平。這說明通過分子標(biāo)記輔助選擇選育的恢復(fù)系R650保持了輪回親本R022 的優(yōu)良性狀，與不育系配制的雜交組合也保持了原有雜交組合的產(chǎn)量水平。

3 討論

為了保留輪回親本的優(yōu)良性狀，在回交過程中可以使用分子標(biāo)記進(jìn)行背景選擇，通過選擇背景回復(fù)率高的個(gè)體參加下一代的回交，能加快受體遺傳背景恢復(fù)的速度。本研究在回交過程中沒有利用分子標(biāo)記進(jìn)行背景選擇，而是在每一次回交過程中選擇農(nóng)藝性狀與輪回親本相似的單株作父本，以加快輪回親本遺傳背景的回復(fù)率，同樣能達(dá)到育種目標(biāo)。

表2 稻瘟病抗性鑒定結(jié)果

表3 各材料農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

培育的恢復(fù)系R650 與不育系巨風(fēng)2A 配制的三系雜交中秈稻新組合巨風(fēng)優(yōu)650 參加了2015—2016 年湖北省中稻品種區(qū)域試驗(yàn)，2018 年完成了生產(chǎn)試驗(yàn)，2019 年8 月通過湖北省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定。區(qū)域試驗(yàn)抗性鑒定結(jié)果顯示，巨風(fēng)優(yōu)650 稻瘟病抗性綜合指數(shù)為2.4 級(jí)，穗瘟損失率最高級(jí)為3 級(jí)，中抗稻瘟病。進(jìn)一步說明Pi1 和Pi2 基因在稻瘟病抗性育種中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。