申屠旭萍, 史嘉騰, 宋 陽, 俞曉平

(中國計量大學生命科學學院, 浙江省生物計量及檢驗檢疫技術重點實驗室, 杭州 310018)

褐飛虱Nilaparvatalugens屬半翅目(Hemiptera)飛虱科(Delphacidae)，是一種只以水稻或野生稻韌皮部汁液為食的遠距離遷飛性害蟲(Xueetal., 2013)。目前，褐飛虱作為亞洲稻區(qū)最主要的害蟲之一(程家安和祝增榮, 2017)，其防治仍然主要依賴于噴施化學農(nóng)藥和種植抗性水稻品種?；瘜W農(nóng)藥能有效控制褐飛虱的發(fā)生，但長期以來大量、單一和頻繁地使用化學殺蟲劑，不僅嚴重污染了環(huán)境，同時也不可避免地造成了褐飛虱對化學殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性。水稻抗蟲品種由于其良好的生態(tài)效應而備受推崇, 但褐飛虱在與水稻抗蟲品種相互作用的過程中，其致害性發(fā)生了變異，致使推廣的抗蟲品種逐漸喪失其原有的抗性(Luetal., 2004; 陳峰等, 2009)。

共生菌在昆蟲漫長的進化史中扮演了舉足輕重的角色，被譽為昆蟲特殊的“多功能器官”(Henryetal., 2015; 楊義婷等, 2016)。與其他刺吸式昆蟲相同，褐飛虱體內(nèi)也含有大量共生菌，主要是以類酵母共生菌(yeast-like symbiont, YLS)為主的共生真菌以及殺雄菌屬Arsenophonus和沃爾巴克氏體Wolbachia等為代表的共生細菌(Tangetal., 2010; 唐明等, 2014)。研究表明，種類豐富的共生菌在功能上同樣具有多樣性，共生菌在褐飛虱的生長、發(fā)育、繁殖、營養(yǎng)代謝和免疫等多方面起到至關重要作用(徐紅星等, 2014; Juetal., 2020)。另有研究證實，褐飛虱的抗藥性以及致害性的發(fā)展也與其體內(nèi)種類繁多的共生菌有著密不可分的聯(lián)系(Luetal., 2004; 禹海鑫, 2013; 廖遜等, 2019)。褐飛虱內(nèi)共生菌存在的部位主要為腹部脂肪體和腸道組織。近年來，研究人員在卵巢、唾液腺以及產(chǎn)卵管附近也發(fā)現(xiàn)了共生菌的存在，這為共生菌在褐飛虱不同組織之間的擴散機制及功能的研究提供了方向(Zhangetal., 2019)。目前褐飛虱共生菌種類多樣性研究主要是采用分子生物學方法和高通量測序技術。本文綜述了褐飛虱內(nèi)共生菌的種類以及它們的功能，期望為進一步闡明褐飛虱內(nèi)共生菌與宿主間的關系提供參考和思路。

1 褐飛虱體內(nèi)共生菌概況

1.1 褐飛虱體內(nèi)共生真菌

早在20世紀60年代，Nasu(1963)就從褐飛虱腹部脂肪體內(nèi)分離到了一類酵母樣的共生真菌即類酵母共生菌(YLS)，并對其形態(tài)進行了描述。研究證實，褐飛虱共生真菌并非由單一菌株組成，隨著分子生物學技術的發(fā)展以及高通量測序技術的推廣應用，褐飛虱腸道、脂肪體、卵巢等組織中越來越多的共生真菌種類被明確(何林懋, 2018; 王天召等, 2019)。Noda等(1995)首次采用18S rDNA序列作為目的序列，對褐飛虱內(nèi)共生真菌進行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)其與子囊菌亞門(Ascomycotina)核菌綱(Pyrenomycetes)麥角菌目(Clavicipitales)的金孢酵母菌Hypomyceschrysospermus親緣關系最近。后續(xù)有關褐飛虱共生菌研究報道中為了突顯Noda在這方面做的重大貢獻，也簡稱其為Noda菌。隨后Suh等(2001)在其基礎上將YLS與其他昆蟲病原菌進行比較分析后認為YLS屬于真子囊菌綱(Euascomycetes)肉座菌目(Hypocreales)麥角菌科(Clavicipitaceae)。此外，張玨鋒等(2009)首次通過卵塊分離培養(yǎng)的方法從褐飛虱卵中成功分離到了嗜鹽梗孢酵母Sterigmatomyceshalophilus和解脂亞羅酵母Yarrowialipolytica兩株類酵母共生菌，而禹海鑫(2013)對褐飛虱腹部脂肪體轉(zhuǎn)錄組測序分析表明確實存在這兩個屬的真菌，這也從側(cè)面證實了褐飛虱類酵母共生菌可經(jīng)卵垂直傳遞給下一代。目前，在褐飛虱體內(nèi)鑒定并報道的共生真菌(測序豐度>0.1%)已有19屬(表1)，其中Noda菌、畢赤酵母屬Pichia、隱球酵母屬Cryptococcussp、假絲酵母屬Candida和亞羅酵母屬Yarrowia為褐飛虱體內(nèi)的常見共生真菌。

1.2 褐飛虱體內(nèi)共生細菌

相比于共生真菌，褐飛虱共生細菌的研究起步較晚，但隨著近年來腸道微生物多樣性研究的興起，褐飛虱腸道細菌的多樣性研究陸續(xù)見報道。研究表明，褐飛虱的共生細菌除了存在于腸道，同時在脂肪體、唾液腺以及卵巢中均有分布(唐明等, 2014; Zhangetal., 2019)。早在21世紀初，Wolbachia就被發(fā)現(xiàn)存在于褐飛虱體內(nèi)(甘波誼等, 2000)，隨后陸續(xù)有更多共生細菌從褐飛虱體內(nèi)被鑒定。但由于褐飛虱內(nèi)共生細菌多為次級共生菌，共生關系不穩(wěn)定，因此不同地理位置、取食不同品種水稻的褐飛虱體內(nèi)共生細菌的種類不盡相同。目前在褐飛虱體內(nèi)鑒定并報道(測序豐度>0.1%)的共生細菌已有53個屬(表2)，其中Wolbachia、殺雄菌屬Arenophonus、腸桿菌屬Enterobacter、不動桿菌屬Acinetobacter、芽孢桿菌屬Bacillus、沙雷菌屬Serratia和醋酸菌屬Asaia為褐飛虱體內(nèi)常見的共生細菌。

表2 褐飛虱體內(nèi)共生細菌(測序豐度>0.1%)Table 2 Symbiotic bacteria in Nilaparvata lugens (sequencing abundance>0.1%)

續(xù)表2 Table 2 continued

2 褐飛虱體內(nèi)共生菌的功能

2.1 營養(yǎng)功能

2.1.1合成固醇類物質(zhì):褐飛虱與其他昆蟲一樣無法通過自身從頭合成膽固醇，而其單一的食性也使其無法從食物中獲取生命活動所必需的膽固醇。研究表明，褐飛虱體內(nèi)的膽固醇合成與體內(nèi)共生菌有緊密聯(lián)系，減菌處理下的飛虱蟲體固醇類物質(zhì)的含量顯著降低(Noda and Saito, 1979)。Xue等(2014)在完成褐飛虱全基因組測序分析后發(fā)現(xiàn)，褐飛虱基因組與其體內(nèi)YLS的基因組在固醇類物質(zhì)合成通路上高度互補。此外YLS基因組中編碼C-22脫飽和酶的基因ERG5發(fā)生了無義突變，因此YLS無法合成自身所需的麥角固醇，而累積的中間產(chǎn)物麥角甾-5,7,24(28)-三烯則通過褐飛虱以及YLS基因組中發(fā)現(xiàn)的7-脫氫膽甾醇還原酶(EC1.3.1.21)和甾醇24-C甲基轉(zhuǎn)移酶(EC2.1.1.41)基因參與合成膽固醇，這恰恰從基因組學上證實了Wetzel等(1992)在飛虱體內(nèi)檢測到膽固醇卻檢測不到麥角固醇的現(xiàn)象。YLS基因組中合成麥角固醇的基因突變，可能是導致YLS無法正常形成細胞膜從而難以離體培養(yǎng)的重要原因之一(范海偉, 2015)。

2.1.2合成必需氨基酸:褐飛虱同樣無法從水稻汁液中獲取全部20種氨基酸作為其生命活動的基本營養(yǎng)物質(zhì)，因此，褐飛虱需要通過自身或者其體內(nèi)共生菌來合成所需的氨基酸。傅強等(2001)將卵高溫減菌處理后發(fā)現(xiàn)：孵化出的若蟲如果用不添加8種必需氨基酸的營養(yǎng)液飼養(yǎng)，羽化率和對照相比顯著降低，說明YLS減少導致8種必需氨基酸合成的量減少，從而影響了褐飛虱的生長發(fā)育。王國超(2005)進一步研究發(fā)現(xiàn)，必需氨基酸的缺失一定程度上能夠促進褐飛虱YLS增殖，從而通過YLS合成必需氨基酸彌補蟲體對這些氨基酸的需求。高通量測序結(jié)果也顯示了褐飛虱本身的基因組注釋的基因無法獨立合成必需氨基酸，但在其YLS基因組中卻發(fā)現(xiàn)了完整的氨基酸代謝通路基因，這同樣證明了YLS在一定程度上彌補了褐飛虱無法從食物中獲取或自身無法合成必需氨基酸的缺陷(Xueetal., 2014)。然而，Zhang等(2019)對褐飛虱脂肪體以及卵巢的共生細菌進行KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，氨基酸的代謝以及生物合成是第二豐富的KEGG通路，說明褐飛虱所需的氨基酸合成也與其體內(nèi)的共生細菌相關，但具體機制尚未闡明，推測共生細菌在這些氨基酸合成通路的輔助因子合成中起重要作用。

氮素循環(huán)通路是褐飛虱氨基酸的另一來源。研究表明褐飛虱與YLS在氮素循環(huán)路徑上具有互補的能力。YLS能與褐飛虱一起對儲存在褐飛虱脂肪體細胞中的尿酸進行利用，兩者互補具有氮素循環(huán)和氨同化通路上的所有基因，兩者中任意一個基因的丟失都將導致這個代謝通路終止(范海偉，2015)。另外，Xue等(2014)還發(fā)現(xiàn)在其他昆蟲基因組中鮮有卻存在于褐飛虱基因組中的編碼尿酸酶的基因，進化過程中這個基因的保留抑或獲得，便于其在尿酸產(chǎn)物不斷增長的情況下更好地實現(xiàn)氮素的循環(huán)利用。這一發(fā)現(xiàn)也合理地解釋了在整蟲以及分離出的YLS中都能檢測到尿酸酶活性的現(xiàn)象(Hongoh and Ishikawa, 1997)。褐飛虱和YLS基因組通過親密的合作，將尿酸成功地轉(zhuǎn)化為氨，并進一步轉(zhuǎn)化為必需氨基酸合成所需的前體(谷氨酸和谷氨酰胺)。

2.1.3合成維生素：維生素作為一大類營養(yǎng)物質(zhì)，同樣是褐飛虱生命活動所必需的?；蚪M分析結(jié)果顯示，褐飛虱脂肪體內(nèi)殺雄菌屬Arenophonus這類共生細菌含有完整的B族維生素合成通路基因，這恰恰也是褐飛虱與YLS基因組中缺失的(Xueetal., 2014)。Ju等(2020)對褐飛虱體內(nèi)另一常見昆蟲共生細菌Wolbachia基因組分析發(fā)現(xiàn)其具有完整的維生素B2和B7的生物合成通路基因，并且進一步證明了缺少Wolbachia的褐飛虱體內(nèi)維生素B2和B7含量顯著降低。這說明了Wolbachia與Arenophonus在褐飛虱體內(nèi)具有類似的功能，均可以為褐飛虱提供B族維生素，與屈呂宇(2013)發(fā)現(xiàn)的Wolbachia與Arenophonus在褐飛虱體內(nèi)具有相似的生態(tài)位且互為競爭關系這一結(jié)果不謀而合。

褐飛虱體內(nèi)共生菌營養(yǎng)功能概括如圖1。

2.2 抗性發(fā)展功能

2.2.1褐飛虱致害性變異：培育抗性水稻作為防治褐飛虱的有效手段，近年來一直面臨著褐飛虱致害性變異的困境。研究表明，褐飛虱體內(nèi)YLS與其致害性變異密切相關(呂仲賢等, 2001; Luetal., 2004)。轉(zhuǎn)錄組學分析同樣證實了褐飛虱內(nèi)共生菌與其致害性變異的緊密關系，禹海鑫(2013)發(fā)現(xiàn)Mudgo抗性水稻飼養(yǎng)的褐飛虱種群中Wolbachia的許多代謝基因有所上調(diào)，并且具有更高的增殖能力，說明Wolbachia在褐飛虱適應Mudgo抗性水稻過程中起關鍵作用。取食不同抗性水稻品種的褐飛虱腸道共生細菌種類以及豐度存在顯著的變化(王天召等, 2019)，并且隨著褐飛虱對抗性水稻的適應性增強，其后代腸道內(nèi)的共生細菌多樣性變化逐漸趨于穩(wěn)定，這說明了褐飛虱致害性的變化與其體內(nèi)共生菌多樣性變化有關(Wangetal., 2015; Ojha and Zhang, 2019)。然而共生菌多樣性影響褐飛虱致害性的具體機理仍未明確。

2.2.2褐飛虱抗藥性發(fā)展：使用化學殺蟲劑防治褐飛虱是目前最經(jīng)濟、常用的手段，然而不可避免地導致褐飛虱對化學農(nóng)藥產(chǎn)生了較高的抗性。目前，褐飛虱抗藥性發(fā)展的報道屢見不鮮，但共生菌在其中的作用保持未知。李香香(2010)在取食了殺菌劑處理的水稻苗的褐飛虱腸道中成功分離并采用氟蟲腈馴化得到了一株不動桿菌屬Acinetobacter細菌，說明了不動桿菌屬細菌可能是褐飛虱對氟蟲腈產(chǎn)生抗性的原因之一。Malathi等(2018)也在野外具有抗藥性的褐飛虱種群的共生細菌基因組中發(fā)現(xiàn)了富含解毒功能的基因。然而，Zhang等(2018)對褐飛虱田間抗性種群以及實驗室敏感種群腸道共生細菌進行功能分析時發(fā)現(xiàn)，這兩個種群的解毒和代謝相關的基因表達沒有顯著差異，說明腸道共生菌并不是直接參與褐飛虱的解毒代謝。唐濤(2019)則用四環(huán)素和環(huán)丙沙星處理田間褐飛虱種群后，發(fā)現(xiàn)其對吡蟲啉等殺蟲劑敏感性顯著增加，而測序和熒光定量PCR分析表明殺菌劑處理后褐飛虱谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和細胞色素P450這些解毒酶活力下調(diào)，同時共生菌Arsenophonus和Acinetobacter的拷貝數(shù)均顯著下降，從側(cè)面印證了褐飛虱的共生菌間接介導了褐飛虱的解毒代謝。而Pang等(2018)則發(fā)現(xiàn)S型的Arsenophonus替代原有共生細菌Arsenophonus能夠降低褐飛虱對殺蟲劑的抗性，轉(zhuǎn)錄組以及代謝物的分析結(jié)果顯示感染S型Arsenophonus的褐飛虱的異質(zhì)代謝能力顯著下降。

2.3 對宿主繁殖的影響

褐飛虱對水稻種植業(yè)的危害巨大，與其強大的繁殖能力有著緊密的關系。早在20世紀80年代，Lee和Hou(1987)就通過高溫以及溶菌酶處理褐飛虱的卵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理后的卵無法孵化。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在卵減菌的情況下，褐飛虱胚胎發(fā)育以及胚后發(fā)育所需的某種蛋白無法合成，并且胚胎的腹節(jié)分化受阻，從而證明了共生菌能影響褐飛虱的繁殖。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，褐飛虱脂肪體內(nèi)的卵黃原蛋白(vitellogenin, Vg)在其胚胎發(fā)育階段起重要作用，而共生菌的垂直傳遞與胚胎吸收Vg在時空上具有顯著的相關性(南國輝, 2016; 王小龍, 2019)。呂仲賢等(2001)則采用喂食抗性水稻使褐飛虱共生菌數(shù)量減少，結(jié)果顯示，共生菌數(shù)量減少的褐飛虱雌成蟲在體重、生長速率以及產(chǎn)卵量等指標與取食敏感品系水稻相比均顯著下降。此外，研究發(fā)現(xiàn)褐飛虱脂肪體內(nèi)共生細菌Wolbachia能夠產(chǎn)生維生素B2和B7，從而直接增加宿主的產(chǎn)卵力(Juetal., 2020)。

3 小結(jié)與展望

共生菌在褐飛虱的生命活動中起到了舉足輕重的作用。褐飛虱體內(nèi)的共生菌由種類豐富的共生真菌與共生細菌組成，而不同種類的共生菌發(fā)揮著不同的功能，維持著褐飛虱體內(nèi)的微生態(tài)平衡。因此，研究褐飛虱共生菌的多樣性，探究其種類組成對了解共生菌與褐飛虱間的關系具有重要的意義。目前，褐飛虱內(nèi)共生菌多樣性的研究已經(jīng)取得了一定的進展，尤其是隨著高通量測序技術的發(fā)展，越來越多共生菌的分類地位被明確，但仍然有相當部分共生菌相關的科學問題亟待探究或者解決。

首先，褐飛虱體內(nèi)到底有多少種共生菌仍未明確。不同翅型、不同發(fā)育階段、不同性別以及不同地理種群或不同抗性種群間的褐飛虱體內(nèi)共生菌是否存在差異?如果是，又存在哪些差異共生菌，占比有什么變化？要想全盤了解褐飛虱體內(nèi)的共生菌，需對不同褐飛虱種群的共生菌多樣性進行系統(tǒng)研究，從中明確各處理間共生菌的差異，為進一步研究共生菌功能如共生菌是如何介導宿主對化學殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性等奠定基礎。

第二，開展某一特定共生菌的功能研究非常困難。迄今針對共生菌功能的研究仍主要停留在整個菌群對褐飛虱的影響，由于褐飛虱YLS的基因組缺失了許多侵染和有性生殖相關的基因，無法脫離宿主獨立增殖，因此其與宿主的共生關系更為緊密，難以分離培養(yǎng)。此外，褐飛虱又不能脫離共生菌單獨存活，也即實際研究中不可能獲得無菌的褐飛虱，這兩方面原因?qū)е码y以對某一種類共生菌的功能進行單獨研究。目前分別有通過抗生素處理除菌和胚胎注射共生菌的方法進行共生菌功能研究(Pangetal., 2018; Juetal., 2020)，但這兩種方法都存在一定的缺陷。通過抗生素處理除菌并不能單獨除去想要研究的單一靶標菌，往往會抑制多種共生菌，所以并不能獲得只有靶標菌存在差異的兩組褐飛虱種群處理組，也就無法說明褐飛虱各生長特性指標或者各參數(shù)變化純粹是由靶標共生菌引起的。胚胎注射方法本身難度系數(shù)極高，因為褐飛虱卵非常小，要在這么小的卵中通過顯微注射方法外源加入共生菌，這操作難度系數(shù)很大，一不小心就會導致卵破裂；同時想要注射共生菌，那么這共生菌必須能離體培養(yǎng)，而從進化角度分析能離體培養(yǎng)的菌往往和宿主共生關系不緊密，研究這些共生菌(次生共生菌)的功能相比初生共生菌在重要性上就處于劣勢；也有學者從不同褐飛虱種群中提取血淋巴注射到另一褐飛虱種群中，但血淋巴中也不僅僅含有要研究的靶標共生菌，注射時也帶入了其他共生菌到褐飛虱體內(nèi)，這對于特定種類共生菌功能的研究也存在缺陷，在后續(xù)的共生菌功能研究中需要嘗試或者開拓新的方法。

第三，褐飛虱體內(nèi)不同組織內(nèi)都含有各種各樣的共生菌，但在組織間的擴散途徑、擴散的種類和機制尚不清楚。目前已明確YLS在褐飛虱體內(nèi)以垂直傳遞的方式進行代次間傳播(Cheng and Hou, 2001; Yukuhiroetal., 2014; Nanetal., 2016)。具體傳遞過程為：脂肪體菌胞中的YLS通過胞吐作用釋放到血腔中，血腔中游離的YLS到達卵巢管，靠近包裹著原初卵母細胞的濾泡細胞，通過胞飲作用進入濾泡細胞，進而到達卵巢管的上皮栓，進入卵細胞聚集在成熟卵的后端(Noda, 1977; Cheng and Hou, 2001; Wuetal., 2019)。卵成熟后，在每個卵的后端能清晰地看到一個圓形的菌胞(Noda, 1977)。進一步研究發(fā)現(xiàn)YLS進入褐飛虱卵巢和卵黃發(fā)生密切相關，并且是由卵黃發(fā)生過程引發(fā)的(Nanetal., 2016)；而隸屬絲氨酸蛋白酶家族的褐飛虱凝固酶3(N.lugensproclotting enzyme-3, NlPCE3)則在卵黃發(fā)生過程中起到了重要的作用(Wuetal., 2019)。那么YLS從脂肪體到血淋巴是受什么調(diào)控，具體的機制又是如何？哪些因素可以影響該過程？是每種共生菌都垂直傳遞到子代還是部分共生菌發(fā)生了垂直傳遞？不同種群間脂肪體YLS到卵中的種類是否存在差異？這些科學問題都有待后續(xù)研究。

第四，既然共生菌和褐飛虱間關系如此緊密，如何充分利用共生菌進行褐飛虱防治？前期我們利用共生菌開展了防治褐飛虱的研究，結(jié)果表明以殺菌劑作為殺蟲劑的助劑，將殺菌劑和殺蟲劑配伍使用，可以達到更好的褐飛虱防治效果，且減少了化學農(nóng)藥的使用量(Shentuetal., 2016)。但是此項研究還有不少科學問題需要闡明，比如：哪種共生菌數(shù)量的變化會導致褐飛虱死亡率顯著上升，也就是關鍵共生菌是什么？是共生細菌還是共生真菌數(shù)量的減少更能導致褐飛虱死亡呢？殺菌劑和殺蟲劑復配制劑中殺菌劑和殺蟲劑是如何協(xié)同發(fā)揮防治褐飛虱的作用？褐飛虱不同階段施藥對防治效果有什么影響，和共生菌之間有什么必然的聯(lián)系？等等。

褐飛虱體內(nèi)共生菌種類豐富多樣，相信上述科學問題的闡明將豐富褐飛虱和共生菌間的共生關系的內(nèi)涵，進一步明確共生菌對褐飛虱的作用，同時也可為以“抑菌-治蟲”方法開展褐飛虱防治研究奠定理論基礎。